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在癌症研究中，微小 RNA（miRNA）功能备受关注，但 miRNA 的鉴定存在争议。研究人员针对此开展研究，发现众多被标注为 miRNA 的小 RNA 并不与 AGO 蛋白结合，无法发挥 miRNA 功能。该研究为准确鉴定 miRNA 提供标准，有助于癌症研究更精准深入。
在癌症的世界里，微小 RNA（miRNA）一直是备受瞩目的明星分子。它作为基因表达的重要调节者，一旦出现失调，就会与肿瘤的发生、发展以及上皮 - 间质转化（EMT，一种在肿瘤转移中起关键作用的发育过程，若被异常激活会促进癌细胞转移）紧密相连。然而，随着研究的深入，一个令人困惑的问题逐渐浮现：基因组中到底有多少真正具有功能的 miRNA 呢？那些被标注为 miRNA 的小 RNA，会不会只是 RNA 降解的非调节产物，却被错误地认定为 miRNA 呢？这个问题就像一团迷雾，笼罩着癌症研究领域，阻碍着科研人员对 miRNA 功能的深入理解，也影响着基于 miRNA 的癌症诊断和治疗策略的发展。为了驱散这团迷雾，来自澳大利亚的研究人员（Centre for Cancer Biology 等多个机构）展开了一项极具意义的研究。
研究人员发现，许多之前在 EMT 和癌症研究中被报道的 “miRNA”，实际上并不能与 Argonaute（AGO）蛋白结合，进而无法形成 RNA 诱导沉默复合体（RISC），也就不能在体内沉默靶基因。这一发现犹如一颗重磅炸弹，颠覆了人们对这些 “miRNA” 的传统认知。要知道，此前有数百篇论文都描述了它们在癌症中的作用，而现在看来，这些研究可能都建立在错误的基础之上。该研究成果发表在《Oncogenesis》杂志上，为癌症研究领域敲响了警钟，也为后续更准确地研究 miRNA 在癌症中的作用指明了方向。
为了开展这项研究，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是免疫共沉淀技术，通过 AGO:RNA 共免疫沉淀实验，研究人员能够确定小 RNA 是否与 AGO 蛋白结合；其次是测序技术，包括小 RNA 测序（small RNAseq）和对细胞核与细胞质进行 RNA 测序，以此来分析不同细胞组分中 RNA 的情况；最后，生物信息分析方法也至关重要，用于处理和解读测序得到的数据，判断 RNA 的类别、丰度等信息 。
下面来看具体的研究结果：
- 注释的 “微小 RNA” 与 AGO 蛋白的关联：研究人员通过对 HMLE（人乳腺上皮细胞）及其经 TGF-β 诱导的间质衍生物 mesHMLE 细胞进行研究，发现 7% 表达量高于 5 cpm（counts per million，每百万计数）的注释 “miRNA” 实际上并不与 AGO 蛋白结合。在其他生物环境（如胶质母细胞瘤和胚胎干细胞）的相关数据集中，这些 “miRNA” 同样不与 AGO 蛋白结合。研究人员将这些虽被报道为 miRNA 但不与 AGO 结合的 RNA 命名为 “nonmiRs”。
- 不结合 AGO 的小 RNA 对报告基因的抑制作用：为了验证 nonmiRs 是否具有 miRNA 的功能，研究人员构建了针对 5 种 nonmiRs 的荧光素酶报告基因，同时以 7 种已证实与 AGO 结合的真实 miRNA 作为阳性对照，并构建了两个基因组中不存在的任意 RNA 序列的报告基因。实验结果显示，当共转染相应的 miRNA 模拟物时，所有报告基因的荧光素酶活性都受到强烈抑制。然而，当使用反义抑制剂处理时，阳性对照 miRNA 的报告基因表达增加，而 nonmiRs 的报告基因表达并未增加，这表明不结合 AGO 的小 RNA 无法像 miRNA 一样发挥功能，同时也说明异位表达 miRNA 模拟物并不能证明内源性小 RNA 就是 miRNA。
- 识别 nonmiRs 的其他标准：考虑到 AGO 结合数据并非对所有小 RNA 都容易获取，研究人员探究了是否有其他特征可用于识别 nonmiRs。在亚细胞定位方面，他们发现 canonical miRNAs 在细胞核和细胞质中都能检测到，而 nonmiRs 几乎只存在于细胞核中；在 RNA 长度和 5’/3’异质性方面，真实 miRNA 通常具有明确的 5’端和适度的长度异质性，而 nonmiRs 则表现出长度延长（常大于 25 nt）和 5’端高度可变的特点。因此，通过检测小 RNA 的亚细胞定位、长度和异质性等特征，有助于识别 nonmiRs。
在研究结论和讨论部分，研究人员指出，他们的研究首次以 AGO 结合这一 miRNA 功能的关键特征为切入点，来区分真实和错误注释的 miRNA。虽然研究中只鉴定出 27 种在 EMT 环境中表达的 “nonmiRs”，但考虑到评估的局限性，实际存在的 nonmiRs 数量可能远不止这些。研究人员强烈建议癌症研究人员在开展新研究时，优先采用严格控制的 miRNA 抑制实验，理想情况下结合 AGO 共沉淀实验，以确定内源性 miRNA 的真实性和功能意义。目前，仍有许多论文错误地将 miRNA 功能归因于 nonmiRs，这可能是由于缺乏明确的识别标准。尽管 MirGeneDB 数据库可作为初步筛选的工具，但还需要更深入的研究。此外，miRNA 的产生途径复杂多样，不能仅依据是否通过典型的 DROSHA/DICER 途径产生来判断其功能。同时，一些满足部分 miRNA 标准但并非全部标准的小 RNA，其功能也存在不确定性。总之，这项研究为癌症研究领域提供了重要的参考，有助于纠正过去对 miRNA 功能的错误认知，推动癌症研究朝着更精准的方向发展。
