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为解决噬菌体在多成员群落和动物宿主中传播动力学研究的技术难题，研究人员开展了 “Phollow 揭示斑马鱼肠道微生物组中噬菌体原位传播动态” 的研究。他们创建 “Phollow” 技术，发现不同来源噬菌体行为差异及抗生素对其影响。该研究为噬菌体疗法提供理论依据。
** 在神秘的微观世界里，噬菌体作为细菌的 “天敌”，时刻影响着微生物群落的平衡。噬菌体不仅能像凶狠的 “捕食者” 一样杀死细菌，还能通过介导新的遗传特性转移，增强细菌的适应性。这一特性使得噬菌体在改善人类和环境健康方面极具潜力，比如利用可控的噬菌体爆发来清除致病微生物，或者促进有益微生物的传播。然而，要真正将噬菌体用于操控细菌群落，就必须深入了解它们在复杂环境中的复制规律。
目前，研究噬菌体在多成员群落和动物宿主中的传播动力学面临着巨大的挑战。在人类和其他动物的胃肠道这个特殊环境中，关于噬菌体生物学的许多问题仍未得到解答。例如，裂解性复制的爆发是在空间上广泛分布，还是局限于局部区域？它们是在快速还是缓慢的时间尺度上发生？噬菌体复制动力学对更广泛的细菌群落有何影响，又会如何作用于动物宿主的细胞和组织？这些问题之所以难以回答，是因为传统研究方法在时空敏感性和分辨率上存在局限，无法精准地捕捉噬菌体的复制位置、持续时间，以及它们是以细胞外病毒粒子还是细胞内原噬菌体的形式存在。
为了攻克这些难题，美国加利福尼亚大学欧文分校（University of California, Irvine）的研究人员开展了一项极具创新性的研究。他们创建了一种名为 “Phollow” 的技术，这是一套基于活细胞成像的工具和技术组合，能够以单病毒粒子分辨率追踪噬菌体在原位的复制和传播过程。该研究成果发表在《Nature Microbiology》上，为噬菌体研究领域带来了新的曙光。
研究人员在开展研究时，运用了多种关键技术方法。首先是构建荧光标记的 “Phollow 噬菌体”，利用 SpyTag:SpyCatcher 标记系统，让噬菌体在细胞内组装时带上荧光标记，感染新宿主后标记颜色改变，便于追踪传播。其次，采用成像技术，如荧光显微镜、成像流式细胞术、超分辨率显微镜等，对噬菌体的复制、组装、分散等过程进行可视化观察和分析 。此外，还通过斑马鱼模型，在体内研究噬菌体的传播动态。
研究结果如下：
- 模型噬菌体的选择：研究人员选择 P2 样噬菌体作为模型系统。这类噬菌体属于有尾噬菌体的 Caudoviricetes 类，能感染超过 120 个细菌属，且具有温和的生活方式，便于研究裂解性和溶原性复制。其裂解性复制可由 DNA 损伤和 “SOS” 反应激活诱导。
- Phollow 噬菌体的设计、构建和感染性：研究人员构建的 Phollow 噬菌体，利用 SpyTag:SpyCatcher 系统实现了对噬菌体的荧光标记。在裂解性复制过程中，SpyCatcher 蛋白会从细菌胞质重新分布到组装的噬菌体衣壳上，宿主裂解后释放出荧光标记的噬菌体病毒粒子。实验表明，Phollow 噬菌体与未标记的噬菌体感染性相似，能很好地模拟野生型噬菌体的复制和传播过程。
- 噬菌体裂解性复制的细胞生物学研究：应用 Phollow 技术，研究人员详细观察了 P2 样噬菌体裂解性复制的细胞内特征。用 DNA 损伤剂丝裂霉素 C（MMC）处理大肠杆菌 Phollow 病毒细胞后，细胞会发生丝状化并形成荧光病毒焦点，最终导致细菌裂解和病毒粒子释放。通过成像流式细胞术量化发现，MMC 处理 1 小时后诱导达到峰值，此时约 20% 的细菌群体参与裂解性复制。此外，研究还发现病毒焦点常呈分散分布，也有蛇形模式，且其平均表面积比单个 P2 样噬菌体衣壳大得多，代表多病毒粒子聚集体。通过扩展显微镜（ExM）和透射电子显微镜（TEM）观察，发现野生型和 Phollow 噬菌体在结构上没有明显差异 。
- 通过流式病毒计量术监测病毒粒子的分散：由于区分病毒粒子与细胞碎片和囊泡具有挑战性，研究人员利用 Phollow 病毒细胞对照菌株开发了一种流式病毒计量术的门控策略。通过该策略，研究人员比较了不同作用机制和最低抑菌浓度（MIC）的基因毒性抗生素诱导的病毒粒子分散情况。发现 MMC 在较宽浓度范围内具有强效活性，环丙沙星在窄浓度范围内诱导病毒粒子产生，甲氧苄啶在中等浓度范围内诱导产生。尽管三种抗生素的诱导曲线不同，但它们刺激裂解性复制的能力相似。
- 在脊椎动物肠道内可视化噬菌体爆发：研究人员将 Phollow 技术与光学透明的斑马鱼幼虫相结合，观察到在斑马鱼肠道内，用甲氧苄啶诱导后，4 小时内就会出现病毒粒子云，8 小时后裂解性复制爆发逐渐减弱，24 小时后病毒粒子基本消失。同时，在外部水环境中也检测到病毒粒子，表明病毒粒子会从肠道排出并在水中持续存在。此外，研究人员还发现来自斑马鱼肠道 Plesiomonas 菌株的噬菌体与来自人类大肠杆菌的噬菌体行为不同，前者能迅速扩散到肝脏和大脑等肠外部位 。
- 体外追踪细菌间噬菌体传播：在体外实验中，研究人员通过标记不同荧光标签，监测了噬菌体在细菌间的传播。实验发现，在诱导裂解性复制后，噬菌体在不同细胞间传播，导致群落组成发生变化。这表明 Phollow 技术能够揭示塑造细菌群落的潜在传播动力学。
- 绘制肠道内噬菌体复制的动态图谱：研究人员在斑马鱼肠道内构建了由两种细菌组成的群落，用甲氧苄啶诱导后，发现噬菌体裂解性复制会导致细菌群落的空间结构迅速重构。在 4 小时时，群落出现空间混合，但成员相对丰度变化不大；24 小时时，发现了水平传播的证据，且第二次诱导时两种噬菌体都被排出到水中。这揭示了肠道细菌群落的空间组织与噬菌体扩散和传播之间存在共动态关系。
在讨论部分，研究人员指出，Phollow 技术为研究噬菌体生物学提供了新的视角，揭示了 P2 样噬菌体复制过程中病毒粒子聚集体的形成和快速分解现象。这种聚集体可能有助于噬菌体逃避抗噬菌体防御系统或保护病毒粒子免受恶劣的细胞外环境影响。在肠道内，噬菌体裂解性复制的爆发速度快，但病毒粒子在肠道内的停留时间短，这可能与肠道的机械作用有关。此外，研究还发现噬菌体爆发能快速改变细菌群落的空间结构，这表明噬菌体复制规律可能通过影响细菌的生长和死亡来塑造群落组织模式。
值得注意的是，来自 Plesiomonas 的 DuoZ11 Phollow 噬菌体能够与斑马鱼组织相互作用并在体内传播，这为研究原核病毒与真核生物的相互作用提供了新的契机。虽然目前还不清楚为什么 DuoZ11 噬菌体能够从肠道扩散，而 DuoHS 噬菌体却不能，但这两种噬菌体在基因上存在差异，后续还需要进一步的比较研究来揭示其潜在机制。
总的来说，这项研究通过创建 Phollow 技术，深入揭示了噬菌体在斑马鱼肠道微生物组中的原位传播动态。这不仅有助于我们更好地理解噬菌体的生物学特性，还为基于噬菌体的微生物组疗法开辟了新的途径。未来，随着研究的不断深入，有望利用这些发现开发出更有效的噬菌体疗法，用于治疗人类疾病和改善环境健康 。**
