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在基因治疗中，AAV 载体用于治疗遗传神经系统疾病时出现剂量依赖性不良事件，机制不明。研究人员利用诱导多能干细胞构建人类中枢神经系统（CNS）细胞模型，研究 AAV 转导的影响。结果发现 AAV 基因组可引发 p53 依赖的 DNA 损伤反应等，该研究为开发更安全的 CNS 导向 AAV 基因疗法提供思路。
基因治疗作为一种新兴的治疗手段，为许多疑难杂症带来了新的希望，尤其是腺相关病毒（AAV）载体介导的基因治疗，在遗传神经系统疾病的治疗方面展现出了一定的潜力。然而，就像一把双刃剑，在临床试验中，AAV 载体虽然取得了一些令人鼓舞的成果，但同时也暴露出了剂量依赖性的不良事件。这些不良事件的出现机制一直如同迷雾，笼罩在科研人员心头，严重阻碍了 AAV 载体基因治疗的进一步发展。为了驱散这层迷雾，来自多个研究机构的科研人员，包括 San Raffaele Telethon Institute for Gene Therapy 等，展开了深入的研究。他们的研究成果发表在了《Nature Communications》杂志上，为我们理解 AAV 载体在中枢神经系统（CNS）中的作用机制提供了重要线索。
科研人员在这项研究中，运用了多种关键技术方法。他们利用人类诱导多能干细胞（hiPSC），通过一系列复杂的分化过程，构建了不同的神经细胞模型，包括 2D 培养的神经元、星形胶质细胞，3D 脑球状体以及混合 2D 培养物等。同时，采用了批量和单细胞转录组学技术，对 AAV 转导后的细胞进行分析，以探究基因表达的变化。此外，还进行了体内实验，将 AAV9 注射到小鼠大脑中，观察其在体内的反应。
下面来看具体的研究结果：
- AAV 转导触发 DNA 损伤反应和细胞死亡：研究人员用不同血清型的 AAV 载体转导 hiPSC 衍生的神经元和星形胶质细胞，发现 AAV2 和 AAV6 的转导水平最高，且能诱导 p53 激活、TNFα 信号通路和炎症反应相关基因的表达。空 AAV9 衣壳无明显转录变化，而完整 AAV9 载体可使 hiPSC 衍生的神经元中磷酸化组蛋白 γH2AX（pγH2AX）和裂解的半胱天冬酶 3（cC3）显著增加，表明 AAV 转导以载体基因组依赖的方式触发 DNA 损伤信号和细胞毒性。
- 单细胞转录组学揭示细胞内信号变化：在更复杂的微环境中，如 hiPSC 衍生的混合 2D 培养物和 3D 脑球状体中，用 AAV9 转导后进行单细胞转录组学分析。结果显示，星形胶质细胞和少突胶质细胞对载体反应最强烈，早期 p53 通路激活，随后炎症和细胞应激信号上调，且这种反应与载体血清型无关。
- 炎症信号与载体基因组及转基因表达相关：通过用携带不同启动子和转基因的 AAV 载体转导脑球状体，研究发现载体基因组可触发 DNA 损伤信号，而转基因表达能调节额外的促炎途径。不同转基因序列也会影响信号传导，且转导细胞与未转导细胞之间可能存在旁分泌信号。
- AAV9 介导的 CNS 转导在体内诱导炎症和细胞应激信号：对小鼠进行体内实验，向小鼠纹状体注射 AAV9 - CAG - GFP 后，通过单细胞核 RNA 测序（snRNAseq）和免疫荧光染色分析。结果表明，AAV9 注射诱导了与 hiPSC 衍生的 CNS 模型相似的信号通路，包括 I 型和 II 型干扰素反应、氧化磷酸化以及 DNA 应激反应等，同时还观察到神经元中 p - γH2AX 焦点的形成、胶质细胞增生和免疫细胞的募集。
- AAV 诱导的炎症信号和细胞凋亡依赖于 p53：研究人员通过实验发现，Toll 样受体 9（TLR9）不是 hiPSC 衍生的神经细胞类型中先天信号的主要介质，RNA 传感通过线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）特异性驱动 AAV 诱导的 I 型干扰素反应，但不影响促炎信号。抑制 p53 可完全消除 AAV 诱导的炎症信号，并减轻神经元的毒性。
- AAV 触发的神经毒性可通过抑制 p53 或 cGAS/STING 来预防：在体外和体内实验中，研究人员测试了一系列抑制剂。结果发现，阻断 cGAS - STING 信号通路或 IL - 1R 介导的炎症可有效预防 AAV 诱导的促炎反应，并减少细胞死亡。在体内，抑制 p53 或 cGAS - STING 通路可调节 AAV 介导的胶质细胞激活。
研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 AAV 转导 CNS 细胞时，核酸传感可触发先天免疫和细胞死亡标记，为理解 AAV 介导的基因治疗中潜在的神经毒性机制提供了重要依据。虽然目前的研究存在一定局限性，如体外和体内模型与临床实际情况可能存在差异，但研究结果仍为开发更安全的 CNS 导向 AAV 基因疗法开辟了新途径。通过进一步研究核酸传感器与炎症反应之间的关系，有望优化 AAV 载体的设计，减少其在基因治疗中的副作用，推动 AAV 载体基因治疗的临床应用。
