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为解决牙髓干细胞（DPSCs）衰老阻碍其在牙齿再生技术中应用的问题，研究人员开展了 O-GlcNAcylation 在 DPSCs 衰老和线粒体自噬中作用的研究。结果发现沉默 OGA 可促进线粒体自噬、抑制 DPSC 衰老，为延缓 DPSC 体外衰老提供新策略。
在牙齿的微观世界里，牙髓干细胞（Dental Pulp Stem Cells，DPSCs）就像一群神奇的 “修复小能手”，它们具备强大的分化和再生能力，在牙髓稳态维持和损伤修复中发挥着关键作用，为牙齿再生带来了无限可能。然而，随着研究的深入，科学家们发现了一个棘手的问题：DPSCs 会随着体外培养时间的增加而衰老。这一衰老过程就像给 “修复小能手” 们戴上了枷锁，严重抑制了它们的增殖和分化能力，大大降低了牙齿再生的潜力。与此同时，线粒体自噬（Mitophagy）这一选择性降解过程，对维持细胞稳态至关重要，可衰老细胞中往往堆积着大量功能失调的线粒体，线粒体自噬功能也出现异常，但它与 DPSC 衰老之间的关系却并不明确。另外，O-GlcNAcylation 这种动态可逆的蛋白质翻译后修饰，虽已被证实与细胞衰老有关，可它在 DPSC 衰老过程中究竟扮演着怎样的角色，同样是个未解之谜。在这样的背景下，为了深入探索 DPSC 衰老的机制，为牙齿再生技术寻找新的突破点，宁波口腔医院生物材料与组织再生工程实验室的研究人员开展了相关研究。
研究人员通过一系列实验，得出了重要结论：沉默 OGA（O-GlcNAcase）能够促进线粒体自噬，抑制 DPSC 衰老，这一过程是通过促进 KLF2（Kruppel-like factor 2）的 O-GlcNAcylation 实现的。这一发现为延缓 DPSC 体外衰老提供了新的策略，具有重要的意义，相关研究成果发表在《BMC Oral Health》杂志上。
研究人员为开展这项研究，用到了以下几个主要关键的技术方法：
- 细胞培养与鉴定：从健康供体（18 - 26 岁）的第三磨牙提取牙髓组织，分离培养 DPSCs，并通过诱导其向成骨细胞和脂肪细胞分化，以及检测细胞表面标志物来鉴定细胞。
- 细胞转染：合成 OGA 和 KLF2 的短发夹 RNA（shRNA），转染 DPSCs，以敲低相应基因的表达。
- 免疫共沉淀（co-IP）：用于评估 OGA 和 KLF2 蛋白之间的相互作用。
- 定量 PCR（qPCR）：检测相关基因的表达水平。
- Western blotting：分析蛋白质的表达和修饰水平。
研究结果如下：
- DPSCs 的多向分化能力：通过成骨和成脂诱导实验，发现 DPSCs 能够分化为成骨细胞和脂肪细胞，且表达干细胞表面标志物，证实所培养细胞为 DPSCs。
- 线粒体自噬参与 DPSC 体外衰老：连续传代培养 DPSCs，收集第 7 代（p7）和第 15 代（p15）细胞。SA-β-gal 染色、TERT 活性检测、Western blotting 和 EdU 实验结果表明，p15 细胞比 p7 细胞更衰老，且线粒体自噬相关标志物水平降低，说明线粒体自噬在衰老的 DPSCs 中受到抑制。
- OGA 在 p15 细胞中表达增加：检测 DPSCs 中 O-GlcNAc、OGA 和 OGT 的水平，发现 p15 细胞中 O-GlcNAc 水平降低，OGA 表达升高，而 OGT 水平无差异，提示 DPSC 衰老与 O-GlcNAcylation 抑制有关，且受 OGA 高表达调控。
- 敲低 OGA 抑制 DPSC 衰老并促进线粒体自噬：在 p15 细胞中敲低 OGA 后，β-gal 阳性细胞减少，TERT 活性增强，衰老相关蛋白 p53、p21 和 p16 水平降低，细胞增殖能力增强，线粒体自噬相关标志物水平升高，表明敲低 OGA 有助于减轻 DPSC 衰老并促进线粒体自噬。
- 敲低 OGA 通过促进 O-GlcNAcylation 稳定 KLF2 蛋白：选择 KLF2 进行分子机制研究，发现敲低 OGA 可促进 KLF2 的 O-GlcNAcylation，提高其蛋白水平。通过预测和验证，确定 S177 是 KLF2 的 O-GlcNAcylation 位点，且敲低 OGA 增强了 KLF2 的蛋白稳定性。
- OGA 通过调节 KLF2 影响 DPSC 衰老和线粒体自噬：在 p15 细胞中转染 shKLF2 敲低 KLF2 表达，结果显示，KLF2 敲低抵消了 OGA 敲低对 DPSC 衰老、TERT 活性、细胞增殖和线粒体自噬的促进作用，表明 OGA 通过上调 KLF2 表达抑制 DPSC 衰老并促进线粒体自噬。
研究结论和讨论部分指出，DPSC 衰老受多种因素影响，年龄增长和体外培养都会导致其增殖和分化能力下降。本研究发现抑制 OGA 可通过促进线粒体自噬抑制 DPSC 衰老，揭示了 O-GlcNAcylation 在 DPSC 衰老中的关键调控作用，为延缓 DPSC 体外衰老提供了新的理论依据和潜在靶点，有望推动牙齿再生技术的发展，为口腔医学领域带来新的突破。
