囊尾蚴膜联蛋白 B1 和 B2 功能鉴定及其在细胞膜修复中的关键作用：为寄生虫病防治开辟新视角

本文聚焦囊尾蚴病，研究囊尾蚴（Cysticercus cellulosae）膜联蛋白（Annexin）B1 和 B2。通过实验，发现其具有抗凝、参与细胞膜修复功能，对揭示囊尾蚴入侵和免疫逃逸机制意义重大，为相关疾病防治及药物靶点开发提供新方向。

　　### 1. 引言
囊尾蚴病是一种严重的食源性人畜共患寄生虫病，由猪带绦虫（Taenia solium）的囊尾蚴幼虫感染引起。猪带绦虫属于带绦科，其囊尾蚴阶段会引发多种健康问题。当囊尾蚴寄生在肌肉或皮下组织时，症状可能不明显，但感染眼睛和大脑会导致严重后果，如视网膜下的囊尾蚴可致视力下降甚至失明，神经囊尾蚴病的临床表现复杂，包括癫痫、头痛、颅内高压等。该疾病在非洲、中美洲、加勒比海地区以及东亚和东南亚部分国家流行。

囊尾蚴病流行的根本原因之一是其复杂的入侵和免疫逃逸机制。囊尾蚴的囊膜作为物理屏障，能防止宿主免疫系统直接接触虫体，其分泌的蛋白质也在免疫逃逸中发挥重要作用，如通过伪装、抑制宿主免疫反应、阻断补体系统等方式实现免疫逃逸。

膜联蛋白（Annexin，ANX）是一类钙依赖的磷脂结合蛋白，具有高度保守的序列。其家族成员可分为高度保守的核心区域（C - 末端）和高度可变的 N - 末端，不同成员的功能差异可能与 N - 末端氨基酸序列有关。膜联蛋白具有多种功能，包括抗炎、维持纤溶平衡、抗凝、调节囊泡运输和控制离子通道形成等。在寄生虫中，膜联蛋白也发挥着重要作用，如参与寄生虫的感染、生殖发育、免疫调节等过程。已有研究报道了囊尾蚴中的膜联蛋白 B1 和 B2，但它们在囊尾蚴入侵和免疫逃逸中的调节机制和作用尚未完全明确，且其对细胞膜的修复功能也有待验证。本研究首次将囊尾蚴的膜联蛋白 B1 和 B2 与细胞膜修复功能联系起来，推测它们在囊尾蚴的入侵和免疫逃逸中起重要作用，为深入理解囊尾蚴的入侵机制提供了新视角。

2. 材料和方法

• 伦理审批和参与同意：本研究获得内蒙古民族大学伦理委员会（批准号 IMUN20190301）和吉林大学伦理委员会（伦理批准号# 2021703）的批准，所有 18 岁以上参与者均知情并签署了知情同意书。
• 动物实验伦理：实验遵循中国实验室动物管理原则，经吉林大学动物保护和使用委员会（20170318）批准，所有实验均按照相关指南和规定进行。
• 实验动物：选用 5 个月大、体重 2.0 ± 0.2 kg 的雌性兔子，饲养在标准常规条件下，猪囊尾蚴阳性血清来源已在发表文章中注明。
• 膜联蛋白 B1 和 B2 的表达：从 GenBank 获取膜联蛋白 B1 和 B2 的基因序列（登录号分别为 AAD34598.1 和 AY998562.1），将目标基因克隆到 pET - 28a (+) 原核表达载体，转化到大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 (DE3) 细胞中，通过不同温度诱导表达，收集细菌后经超声破碎，分别收集上清和沉淀，通过 SDS - PAGE 检测蛋白表达。
• 膜联蛋白 B1 和 B2 的纯化：培养细菌，诱导蛋白表达后收集菌体，超声破碎获取粗蛋白。利用 Ni - NTA 亲和层析柱纯化蛋白，用不同浓度咪唑洗脱，透析、浓缩、过滤后测定蛋白浓度，保存于 - 80°C。
• SDS - PAGE 和蛋白质免疫印迹（western blot）：用 12% 聚丙烯酰胺凝胶分离目标蛋白，考马斯亮蓝染色、脱色。纯化蛋白经凝胶分离后转移到 NC 膜上，与囊尾蚴阳性血清或抗 His 单克隆抗体孵育，再与 HRP 标记的二抗孵育，通过化学发光底物系统检测免疫反应蛋白。
• 多克隆抗体制备：以重组蛋白 B1 和 B2 为免疫抗原，与弗氏完全佐剂乳化后皮下注射免疫兔子，间隔 15 天进行后续免疫，多次免疫后通过耳静脉采血。用 ELISA 测定多克隆抗体效价，western blot 测定抗体特异性。
• 免疫组织化学（Immunohistochemistry，IHC）：按照已报道方法进行 IHC 实验，对囊尾蚴切片进行脱蜡、水化、阻断内源性过氧化物酶、抗原修复等处理，然后与抗膜联蛋白 B1/B2 多克隆抗体孵育，再与生物素标记的二抗孵育，DAB 显色，苏木精复染。
• 膜联蛋白 B1 和 B2 的凝血酶原时间（Prothrombin Time，PT）和活化部分凝血活酶时间（Activated Partial Thromboplastin Time，APTT）测定：收集 10 名健康人志愿者的静脉血，分离血浆。将重组膜联蛋白 B1 和 B2 分别加入血浆中，设置不同浓度梯度，以原血浆、牛血清白蛋白（BSA，200 μg/mL）和生理盐水（NS）处理的血浆为对照，按照试剂盒说明书用半自动凝血仪测定 APTT 和 PT，每个样本重复测定 3 次，用单因素方差分析（ANOVA）进行统计分析。
• 脂质体结合试验：采用文献中的方法 A 并稍作修改，在阻断液中加入 1mM CaCl₂，每个斑点含 5 μg 不同比例的脂质（DPPS/DPPC），进行脂质体结合试验。
• C2C12 细胞培养和转染：C2C12 细胞（小鼠成肌细胞）在含 1% 青霉素 - 链霉素溶液和 10% 胎牛血清（FBS）的基础培养基（DMEM）中，于含 5% CO₂的细胞培养箱中 37°C 培养。细胞生长至 70 - 90% 密度时，用 Lipofectamine 2000 转染质粒（pCDNA3.1 - His - B1 和 pCDNA3.1 - His - B2），转染 8 小时后更换为分化培养基（高糖 DMEM 含 1% 青霉素 - 链霉素溶液和 2% 马血清），培养 3 天获得肌管，提取总细胞蛋白进行 western blot 验证转染效率。
• 活细胞激光损伤后细胞膜修复动力学检测：参考文献中的 Protocol A，用 405nm 紫外消融激光照射细胞，设置特定参数，用 60× 物镜采集图像，在损伤前和损伤后不同时间点成像，测定 FM1 - 43 染料荧光强度，计算荧光强度变化（F/F0），每个条件至少检测 15 个细胞，进行 3 次独立实验，用曲线下面积（AUC）分析和非配对 Welch’s t 检验进行统计分析。
• 数据分析：实验结果以均值 ± 标准差（SD）表示，使用 SPSS 22 统计软件进行分析。

3. 结果

• 膜联蛋白 B1 和 B2 的表达、纯化及 western blot 分析：pET - 28a - Annexin B1 和 pET - 28a - Annexin B2 在 20°C 和 37°C 经 IPTG 诱导培养后，在约 35 KDa 处出现目标条带，蛋白在上清和沉淀中均有表达，20°C 时沉淀中的蛋白表达量更高且总蛋白表达量也高于 37°C。选择 20°C 上清中的蛋白进行后续纯化，经 500 mM 咪唑洗脱后获得高纯度的膜联蛋白 B1 和 B2。western blot 结果显示，B1 和 B2 能与囊尾蚴阳性血清和抗 His 单克隆抗体反应，但不与猪阴性血清反应，表明蛋白具有良好的反应性。
• 多克隆抗体制备结果：多克隆抗体能与目标位置的蛋白反应，而兔阴性血清不反应，说明多克隆抗体特异性良好。ELISA 结果显示，兔阴性血清对两种抗原无反应，抗体效价为 0，两种蛋白对应的多克隆抗体效价在 35 天达到最高，为 1:1024000。
• 膜联蛋白在囊尾蚴中的免疫定位：免疫组织化学结果显示，在 4×、10× 和 20× 物镜下观察，膜联蛋白 B1 主要位于囊尾蚴的体表和消化腺表面，阴性对照无特异性染色。膜联蛋白 B2 也位于囊尾蚴的体表。
• 抗凝活性：在 APTT 和 PT 测定中，当血浆中膜联蛋白 B1 浓度低于 100 μg/mL 时，各实验组与对照组凝血时间差异不显著；浓度升高后，凝血时间逐渐延长，B1 浓度达到 175 μg/mL 时，APTT 首次超过正常范围 10s 以上，200 μg/mL 时达到最长。膜联蛋白 B2 浓度低于 50 μg/mL 时，凝血时间无显著变化，浓度升高后，凝血时间延长更明显，200 μg/mL 时部分血浆出现 “不凝血” 状态。总体上，膜联蛋白 B2 对凝血系统的影响比 B1 更强。同时，排除了血浆稀释和蛋白浓度对凝血过程的干扰。
• 脂质体结合试验结果：脂质体结合试验表明，在 1mM CaCl₂存在下，膜联蛋白 B1 和 B2 更倾向于结合 DPPS 而非 DPPC，且 B2 的结合能力可能比 B1 弱。
• 转染效率检测结果：western blot 检测转染效率显示，转染 pCDNA3.1 - His - B1 和 pCDNA3.1 - His - B2 的 C2C12 细胞出现目标条带且较厚，未转染的细胞无特异性条带，表明质粒成功转染且转染效率高。
• 细胞膜损伤和修复试验结果：用激光损伤 C2C12 细胞后，通过 FM1 - 43 染料检测细胞膜完整性。结果显示，转染膜联蛋白 B1 和 B2 基因的细胞在激光损伤后，细胞膜修复时间明显早于普通细胞，推测 B1 和 B2 在细胞膜早期修复中起关键作用。同时，Ca²⁺在细胞膜修复过程中起重要作用，排除了转染对细胞膜修复的影响。

4. 讨论

本研究对囊尾蚴膜联蛋白 B1 和 B2 进行了表达、纯化、抗原组织定位、凝血功能测定、磷脂结合活性测定和细胞膜修复检测，发现它们在囊尾蚴入侵过程中起关键作用。

膜联蛋白通常为细胞质或细胞骨架蛋白，但部分也存在于细胞外区域。虽然囊尾蚴膜联蛋白 B1 和 B2 缺乏外分泌所需的信号肽序列，但可能是分泌蛋白。其他寄生虫的膜联蛋白也有类似情况，且在维持虫体结构完整性、参与运动、消化吸收营养等方面发挥作用，因此推测囊尾蚴膜联蛋白 B1 和 B2 也具有类似功能。

在凝血功能方面，本研究结果与以往研究有所不同。本实验中，膜联蛋白 B1 和 B2 在达到一定浓度时，对 APTT 和 PT 均有明显影响，且 B2 作用更强。推测它们通过竞争性结合磷脂（如磷脂酰丝氨酸），干扰活化凝血复合物的形成，从而抑制内源性和外源性凝血途径，在囊尾蚴穿透血管和迁移过程中发挥抗凝作用。

细胞膜是细胞与外界环境的重要屏障，细胞具有有效的细胞膜修复机制。本研究采用 UV 消融激光诱导细胞膜损伤并结合活细胞成像技术，监测细胞膜修复动态过程。实验中部分细胞激光损伤后出现囊泡突起，这可能是细胞抵抗细胞膜损伤的一种机制。与参考研究相比，本研究中细胞修复时间延迟，可能是由于显微镜参数和损伤持续时间不同导致损伤程度不一致。在细胞膜修复过程中，观察到细胞膜延伸 “细丝” 修复膜缺陷，推测与其他研究中 annexin 参与的细胞膜修复过程类似，囊尾蚴膜联蛋白 B1 和 B2 可能通过类似机制参与细胞膜修复，但具体过程和与其他蛋白或磷脂的相互作用仍需进一步研究。

本研究初步确定了囊尾蚴膜联蛋白 B1 和 B2 的功能，为开发抗囊尾蚴病药物和早期防治提供了新视角，但它们是否能通过调节免疫细胞的趋化和增殖参与免疫逃逸尚不清楚。

5. 结论

本研究成功表达并纯化了囊尾蚴膜联蛋白 B1 和 B2，发现它们位于囊尾蚴体表和内部消化腺表面。这两种蛋白在达到一定浓度时会延长内源性和外源性凝血途径的时间，且更倾向于结合 PS 而非 PC。转染 B1 和 B2 基因的 C2C12 细胞在激光损伤后修复细胞膜的时间更短。这些发现为深入理解囊尾蚴的入侵机制提供了新视角和有价值的线索。