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为探究弓形虫（Toxoplasma gondii）跨菌株和宿主的毒力因子，研究人员开展了针对弓形虫分泌组的体内 CRISPR-Cas9 筛选研究。结果发现致密颗粒蛋白 12（GRA12）是关键毒力因子，其缺失影响寄生虫存活。该研究有助于深入理解弓形虫致病机制。
在神秘的微生物世界里，弓形虫（
Toxoplasma gondii）是一种极为特殊的存在。它就像一个 “潜伏高手”，能感染全球范围内众多温血动物的任何有核细胞，包括人类。弓形虫的不同菌株在毒力上差异巨大，比如常见的 I、II、III 型菌株，毒力依次递减，还有在南美洲出现的 “非典型” 菌株，曾引发多起致死性疫情。过去，科研人员致力于寻找让某些菌株更具致病性的分泌毒力因子，但对于能让弓形虫在所有宿主中持续存在的蛋白却一无所知。这就好比在黑暗中摸索，虽然有了一些零散的发现，却始终找不到那把能解开谜团的关键钥匙。为了填补这一知识空白，来自英国弗朗西斯?克里克研究所（The Francis Crick Institute）和葡萄牙古尔班基安分子医学研究所（Gulbenkian Institute for Molecular Medicine）等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了弓形虫致病机制的重要奥秘。
研究人员开展了一项系统性的体内 CRISPR-Cas9 筛选研究。他们针对弓形虫的分泌组构建了混合 CRISPR 突变体文库，这些文库涵盖了不同类型的弓形虫菌株，包括 I 型、II 型、III 型以及非典型的 VAND 菌株。随后，将这些突变体文库分别注射到不同品系的小鼠体内，通过分析感染前后寄生虫中 sgRNA 的相对丰度，来筛选对寄生虫存活至关重要的毒力因子。
研究结果主要如下：
- 筛选出关键毒力因子 GRA12：通过体内 CRISPR 筛选，研究人员发现致密颗粒蛋白 12（GRA12）在所有测试的寄生虫菌株和小鼠遗传背景中，都是最为关键的分泌型毒力因子。无论寄生虫和小鼠的基因如何变化，GRA12 缺失都会显著降低寄生虫的适应性。例如，在对不同菌株（如 RH、PRU、VEG、VAND）进行筛选时，GRA12 在所有菌株中的表现都与寄生虫的存活密切相关。
- GRA12 在体内的毒力验证：在 IRG 抗性小鼠模型中，研究人员构建了 ΔGRA12 和 GRA12 互补菌株。实验结果表明，缺乏 GRA12 的寄生虫感染小鼠后，小鼠存活率显著提高，而补充 GRA12 后，寄生虫的致死性恢复，这充分证明了 GRA12 在体内的毒力作用。
- GRA12 对巨噬细胞感染的影响：巨噬细胞是弓形虫感染急性期腹膜中的主要感染细胞类型。研究人员利用 CRISPR 筛选技术，在 I 型 RH 敲除池感染的 PWD/PhJ 小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）中进行研究。结果显示，GRA12 缺失导致寄生虫在 IFNγ 预处理的巨噬细胞中清除率显著增加，表明 GRA12 对弓形虫在巨噬细胞中的存活至关重要。
- GRA12 缺失引发宿主细胞死亡：研究发现，缺乏 GRA12 会导致宿主细胞在感染弓形虫后发生调节性坏死。通过检测细胞死亡相关指标，如细胞对碘化丙啶的摄取、坏死相关蛋白 HMGB1 的释放等，证实了这一结论。进一步研究发现，早期寄生虫逸出是导致细胞死亡增加的部分原因。
- GRA12 对寄生虫液泡和免疫蛋白招募的影响：GRA12 定位于寄生虫的液泡内，其缺失会导致液泡空间塌陷，并且宿主免疫蛋白如 IRGd、IRGb10 和 GBP2 向液泡的招募显著减少，这表明 GRA12 在维持液泡结构和调节宿主免疫反应方面发挥着重要作用。
- 相关寄生虫 GRA12 同源物的功能：研究人员发现，与弓形虫密切相关的球虫寄生虫（如 Hammondia hammondi 和 Neospora caninum）的 GRA12 同源物，能够拯救 Toxoplasma ΔGRA12 的限制，这表明 GRA12 的功能在相关寄生虫中可能是保守的。
研究结论和讨论部分表明，GRA12 是首个被证实能在不同小鼠亚种和寄生虫菌株中发挥作用的毒力因子。它的缺失会导致感染细胞迅速死亡，虽然早期逸出部分解释了宿主细胞死亡增加的现象，但可能还有其他未知的细胞死亡途径被激活。GRA12 似乎并不跨膜与宿主蛋白相互作用，研究人员推测它可能在稳定寄生泡膜（PVM）方面发挥作用。此外，除了 GRA12，研究还发现 GRA45、GRA61、GRA50 和 GRA23 等蛋白的缺失也会降低寄生虫在体内的存活率，但它们的具体功能仍有待进一步探索。同时，研究还鉴定出了一些菌株特异性的效应蛋白，如 ROP18 在不同菌株和小鼠品系中的作用差异，以及 GRA57、GRA70、GRA71 在 VAND 菌株中的独特表现，这些都为后续研究提供了重要线索。
总的来说，这项研究首次明确了 GRA12 作为弓形虫跨菌株和宿主的关键毒力因子，为深入理解弓形虫的致病机制提供了重要依据。它不仅揭示了弓形虫在不同宿主中生存的奥秘，还为开发针对弓形虫感染的新治疗策略和干预措施奠定了理论基础。未来，围绕 GRA12 和其他相关毒力因子的研究有望为防控弓形虫感染带来新的突破。
研究人员在开展研究时，主要用到了以下关键技术方法：
- CRISPR-Cas9 技术：构建针对弓形虫分泌组的 sgRNA 文库，通过转染寄生虫，实现对特定基因的敲除，进而筛选毒力因子。
- 动物实验：选用不同品系的小鼠（如 C57BL/6J、PWD/PhJ、CAST/EiJ）和大鼠，进行体内感染实验，观察寄生虫的存活和致病情况。
- 细胞实验：利用小鼠骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs）、人包皮成纤维细胞（HFFs）和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）等细胞系，进行体外感染和相关检测，如限制试验、细胞死亡检测等。
- 基因编辑和验证技术：构建各种基因敲除和互补菌株，并通过 PCR、免疫荧光、Western blot 等方法进行验证。
- 蛋白质分析技术：运用蛋白质共免疫沉淀（co-IP）结合质谱分析，鉴定 GRA12 的相互作用蛋白；通过免疫荧光和透射电子显微镜（TEM）观察蛋白质定位和细胞结构变化。
