线粒体膜电位升高：Dnmt3a 突变克隆性造血的治疗新靶点

为探究 Dnmt3a 突变的造血干细胞和祖细胞（HSPCs）在衰老环境中获得竞争优势的机制，研究人员以小鼠为模型开展研究。结果发现突变 HSPCs 线粒体呼吸增强，利用这一特性，长链烷基 - TPP 分子可削弱其竞争优势。该研究为治疗相关疾病提供新方向。

　　在人体的生命长河中，造血干细胞和祖细胞（HSPCs）就像一群勤劳的 “工匠”，持续维持着造血功能，确保成熟血细胞的平衡产出。然而，随着年龄增长，一个名为克隆性造血（CH）的 “麻烦制造者” 悄然出现。CH 是指部分 HSPCs 因获得体细胞突变而拥有了选择适应性优势，就如同这些 “工匠” 中出现了一些特殊成员，它们开始改变工作方式。其中，DNA 甲基转移酶 DNMT3A 发生体细胞突变的情况最为常见。虽然 CH 本身并非一种明确的病理状态，但它却与许多与衰老相关的疾病紧密相连，比如心血管疾病、血液系统恶性肿瘤以及炎症性骨丢失等，就像一颗隐藏的 “定时炸弹”，随时可能引发健康危机。因此，弄清楚携带 DNMT3A 等体细胞突变的 HSPCs 在衰老环境中如何以及为何能获得竞争优势，成为了医学研究领域亟待攻克的难题，这也为预防那些会增加疾病风险的克隆扩增提供了关键的干预机会。

为了解开这个谜团，来自美国杰克逊实验室（The Jackson Laboratory）、加拿大公主玛格丽特癌症中心（Princess Margaret Cancer Centre）等多个研究机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法来开展研究。在动物模型构建方面，利用特定的基因工程小鼠，如 Dnmt3a^R878H/+小鼠等模拟人类的相关情况；细胞功能检测上，运用 Seahorse 细胞外代谢通量分析等技术，精准测量细胞呼吸等代谢指标；在分子机制研究中，借助全基因组亚硫酸氢盐测序、单细胞 RNA 测序等技术，深入探究基因表达和甲基化状态。

研究结果如下：

1. Dnmt3a 突变 HSPCs 的竞争优势与线粒体呼吸的关系：研究人员通过竞争性骨髓移植实验，将来自 Dnmt3a^R878H/+小鼠（模拟人类 DNMT3A 突变造血）的供体 CD45.2⁺骨髓细胞与野生型 CD45.1⁺骨髓细胞按 1:1 混合，移植到 Igf1 条件性敲除或正常的受体小鼠体内。结果发现，在 Igf1 缺陷的受体小鼠中，Dnmt3a^R878H/+造血细胞在移植 28 周后的外周血中具有更强的竞争优势，且骨髓中 Dnmt3a^R878H/+造血干细胞的频率和总数也有所增加，同时还维持了成熟细胞谱系的平衡组成。进一步研究表明，Dnmt3a^R878H/+HSPCs 在未受刺激时，其最大呼吸和备用呼吸能力均高于对照组 HSPCs，且这一现象在直接从小鼠体内分离的细胞中也得到了证实，而两者的糖酵解能力并无差异。此外，研究人员还发现 Tet2 HSPCs 也有类似的呼吸增强表型，这表明增强的线粒体呼吸可能是 CH 相关突变的一个共同特征。
2. Dnmt3a 突变 HSPCs 线粒体膜电位升高的机制：通过对 Dnmt3a^R878H/+和对照 HSCs 进行全基因组亚硫酸氢盐测序，研究人员发现 Dnmt3a^R878H/+HSCs 中 DNA 低甲基化的基因富含氧化磷酸化基因特征。对已发表的转录组和 DNA 甲基化数据集分析也表明，在小鼠和人类的 Dnmt3a 突变或敲除的 HSPCs 中，DNA 低甲基化和转录表达增加的基因都与氧化磷酸化相关。进一步研究发现，这些基因包括电子传递链超复合物的介导因子（如 Cox7a2l、Ndufa6 等）、ETC 复合物 V 活性相关基因（如 Atp6v0a1、Atp6v1b2）以及线粒体 DNA 和 RNA 合成相关基因（如 Slc25a33）等。其中，Cox7a2l 在所有数据集中均表现为低甲基化且表达增加，它对线粒体效率和线粒体膜电位（Δψ_m）至关重要。通过功能分析，研究人员发现 Dnmt3a^R878H/+HSCs 的 Δψ_m相比对照 HSCs 有所增加，同时其对带正电的钙离子的摄取也增强，但线粒体的体积、数量、形态以及线粒体 DNA 含量并无明显变化。这表明 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 中增强的线粒体细胞呼吸是 Δψ_m升高的结果，而非线粒体形态或数量的改变。
3. 靶向 Dnmt3a 突变 HSPCs 线粒体呼吸的效果：利用 SCENITH 检测技术，研究人员发现 Dnmt3a^R878H/+HSCs 对寡霉素靶向的氧化磷酸化的依赖性更强，当线粒体氧化磷酸化被抑制时，其糖酵解能力会降低。亲脂性三苯基膦（TPP）分子，如线粒体醌（MitoQ），可以靶向增强的电子传递链功能和超复合物形成。研究发现，MitoQ 能降低 Dnmt3a^R878H/+HSCs 的代谢活性，而对对照 HSCs 无明显影响。在人类细胞中，敲低 DNMT3A 的原代脐血 CD34 HSPCs 也表现出类似的呼吸增强表型，且 MitoQ 处理能将这些参数降低至与对照 HSPCs 一致的水平。此外，研究人员还发现长链烷基 - TPP 分子（如 MitoQ、d - TPP）能够特异性地积累在 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 的线粒体中，降低其线粒体呼吸和备用呼吸能力，且 d - TPP 处理还会使 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 的糖酵解能力下降。通过质谱分析，证实了 MitoQ 在 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 线粒体中的积累量高于对照 HSPCs。
4. MitoQ 对 Dnmt3a 突变 HSPCs 的影响机制：通过单细胞 RNA 测序分析 MitoQ 对 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 的转录影响，研究人员发现 MitoQ 处理会降低 Dnmt3a^R878H/+HSCs 中与 Δψ_m、线粒体转运和内膜导入相关的分子特征的表达，同时增加与溶酶体、线粒体膜通透性、细胞色素 C 释放和凋亡相关的分子特征的表达。在细胞水平上，MitoQ 处理会导致 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 的线粒体过渡孔开放、线粒体去极化、Δψ_m降低、线粒体肿胀以及凋亡细胞频率增加，而对对照 HSPCs 的细胞周期有影响，但对 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 的细胞周期无明显影响。
5. 长链烷基 - TPP 分子对 Dnmt3a 突变 HSPCs 竞争优势的影响：体外实验中，MitoQ 和 d - TPP 处理均能降低 Dnmt3a^R878H/+HSPCs 的二次集落形成单位（CFU）再接种能力，而短链的 m - TPP 则无此作用。体内实验中，将对照或 Dnmt3a^R878H/+骨髓细胞移植到 9 个月大的受体小鼠体内，待小鼠年龄增长到 12 个月时，给予 MitoQ 处理 5 天。结果发现，MitoQ 处理显著降低了 Dnmt3a^R878H/+细胞在造血过程中的贡献，使其比例与对照细胞相似。在人类细胞实验中，对敲低 DNMT3A 的脐血 CD34 HSPCs 进行体外竞争培养，添加 MitoQ 后，显著降低了其竞争生长优势。

综上所述，该研究揭示了 Dnmt3a 突变的 HSPCs 通过升高线粒体膜电位和细胞呼吸获得了相对于野生型 HSPCs 的竞争优势。这一过程与 DNA 低甲基化以及电子传递链和呼吸超复合物形成相关成分的表达增加有关。长链烷基 - TPP 分子能够特异性地靶向 Dnmt3a 突变的 HSPCs，降低其线粒体呼吸，诱导线粒体凋亡途径，从而消除其竞争优势。而且，在人类 DNMT3A 敲低的 HSPCs 中也观察到了类似的现象，这表明该机制在物种间具有保守性，为相关疾病的治疗提供了新的潜在靶点和治疗策略。此外，像 MitoQ 这样的线粒体靶向化合物，不仅能够减少 Dnmt3a 突变的造血，还可能通过其抗氧化功能增强野生型衰老 HSC 的功能，在理论上有望降低与衰老和 CH 相关疾病的风险，为未来的临床治疗带来了新的希望和方向。