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为探究 DON 除谷氨酰胺代谢途径外的调控靶点及 p53 活性的调控机制，复旦大学等机构的研究人员开展研究。结果发现嘧啶合酶 CAD 可使 p53 去酰胺化并失活，DON 能抑制 CAD 恢复 p53 活性。该研究为癌症治疗策略提供了新方向。
在生命的微观世界里，细胞的正常运作与各种调控机制息息相关，其中 p53 蛋白扮演着至关重要的角色。p53 作为著名的肿瘤抑制因子（tumor suppressor），在应对 DNA 损伤和代谢改变时，对调节细胞周期（cell cycle）起着核心作用。它就像细胞的 “安全卫士”，一旦发现异常，便迅速行动，阻止细胞异常增殖。然而，p53 的稳定性和活性主要受翻译后修饰（post - translational modifications，PTMs）的调控，而去酰胺化这种修饰是否以及如何在体内调节 p53 的活性，一直是个未解之谜。
6 - 重氮 - 5 - 氧代 - L - 正亮氨酸（6 - diazo - 5 - oxo - L - norleucine，DON）作为一种谷氨酰胺类似物，能抑制谷氨酰胺代谢，此前它在癌症治疗中的非代谢功能却被忽视。为了揭开这些谜团，来自复旦大学附属妇产科医院、生命科学学院、上海代谢重塑与健康重点实验室等多个机构的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Research》杂志上，为我们理解肿瘤发生机制和癌症治疗提供了新的视角。
研究人员在此次研究中，主要运用了 RNA 测序（RNA - seq）、免疫印迹（western blotting）、代谢组学分析等关键技术。其中 RNA - seq 用于检测基因表达变化，免疫印迹用于分析蛋白质表达水平，代谢组学分析则助力探究细胞内代谢物的变化情况。此外，研究还涉及构建多种细胞系，如 p53-/- HCT116 细胞系、CAD - 敲低和 CAD - 过表达的 HCT116 细胞系等，以及使用小鼠异种移植模型进行体内实验。
DON 通过激活 p53 信号通路抑制细胞增殖
研究人员发现，与 DMSO 对照组相比，DON 处理的细胞数量显著减少，同时细胞周期停滞并诱导凋亡。RNA - seq 实验显示，DON 处理组中差异上调的基因在 p53 信号通路中显著富集，这一结果在多种细胞系中通过定量逆转录 PCR（RT - qPCR）和免疫印迹实验得到进一步证实。为了确定 DON 是否主要通过 p53 信号通路抑制细胞增殖，研究人员构建了 p53-/- HCT116 细胞系。结果表明，DON 对 p53 野生型（WT）细胞的生长抑制作用明显，而在 p53 缺陷型细胞中，这种抑制作用显著减弱，p53 下游靶基因也不再对 DON 处理产生响应。这一系列实验充分证明，DON 主要依赖 p53 信号通路的激活来抑制细胞增殖。
DON 对 p53 活性的调节不依赖嘧啶代谢中断
通过对 HCT116 细胞进行细胞内靶向代谢组学分析，研究人员发现 DON 处理后，嘧啶合成相关代谢物发生显著变化，这表明 DON 抑制了 CAD 的活性。为了探究嘧啶合成中断是否激活 p53 信号，研究人员分别使用布雷喹那（brequinar，BQ）和吡唑呋喃（pyrazofurin，PZ）抑制二氢乳清酸脱氢酶（dihydroorotate dehydrogenase，DHODH）和尿苷 5’ - 单磷酸合酶（uridine 5’ - monophosphate synthase，UMPS）。结果显示，DON 能显著激活 p53 靶基因，而 BQ 和 PZ 的作用则较弱。进一步实验排除了其他受 DON 影响的代谢物或嘧啶合成抑制导致 p53 激活的可能性，说明 DON 对 p53 活性的调节独立于 CAD 抑制引起的嘧啶代谢中断。
CAD 通过去酰胺化调节 p53 活性
CAD 作为嘧啶合成中的关键酶，与细胞周期进展密切相关。研究人员构建了稳定的 CAD - 敲低和 CAD - 过表达 HCT116 细胞系，免疫印迹实验表明，CAD 缺失上调 p53 及其下游靶标，而 CAD 过表达则抑制 p53 活性。考虑到 CAD 的非代谢去酰胺酶活性和 DON 的去酰胺酶抑制剂作用，研究人员推测 CAD 可能通过去酰胺化调节 p53 活性。通过基于毛细管电泳的电荷分离和免疫印迹实验，证实了 DON 可阻止 p53 的去酰胺化，CAD 过表达使 p53 电荷向负向移动，而 CAD 缺失则产生相反效果。此外，研究还发现血清激活的 mTORC1 信号通路可通过 S6 激酶刺激 CAD 在 Ser1859 位点磷酸化，进而导致 p53 失活。单独敲低不同的去酰胺酶实验表明，只有 CAD 敲低能显著增加 p53 活性，且共免疫沉淀实验证实了 p53 与 CAD 之间的相互作用。
CAD 对 p53 介导的细胞增殖的影响
研究人员发现，CAD 缺失显著减缓 p53+/+细胞的生长，但对 p53-/-细胞影响较小。在异种移植模型中，DON 对 p53 WT 肿瘤的生长抑制作用明显，而对 p53 缺失肿瘤的抑制作用有限。CAD 过表达在 p53 WT 细胞中显著促进肿瘤生长，在 p53 缺失细胞中作用则无明显差异。这些结果表明，在存在 WT p53 蛋白和高水平 CAD 表达的情况下，DON 能更有效地抑制肿瘤生长。
去酰胺化对 p53 功能的影响及临床意义
研究人员通过液相色谱 - 串联质谱（LC - MS）鉴定出 p53 中 8 个天冬酰胺残基发生去酰胺化转变为天冬氨酸。体外去酰胺化实验证实了 CAD 对 p53 蛋白的去酰胺化酶活性。为探究去酰胺化对 p53 功能的影响，研究人员构建了模拟去酰胺化状态的突变体。结果显示，N235D 和 N239D 突变几乎完全消除了 p53 对其靶基因的转录活性，而将 N235 和 N239 突变为丙氨酸则维持甚至增强了 p53 的功能。内源性 N235D 或 N239D 突变的 TPC1 细胞系进一步证实了这些发现，这些突变细胞增殖更快，对 DON 的抑制作用敏感性降低。临床数据分析表明，携带 WT TP53 的患者中 CAD 蛋白水平显著高于携带突变 TP53 的患者，且 CAD 表达与 WT TP53 患者的生存率呈显著负相关，在突变 TP53 患者中这种相关性则不明显。
综上所述，该研究揭示了去酰胺化是 p53 的一种新的翻译后修饰，对抑制 p53 活性至关重要。CAD 除了在嘧啶生物合成中的作用外，还可通过去酰胺化抑制 p53，促进肿瘤生长。高 CAD 表达可能通过去酰胺化使 WT p53 失活，推动肿瘤进展，其作用类似于 p53 功能丧失突变。这一研究为理解肿瘤发生机制提供了新的理论依据，也为癌症治疗提供了潜在的策略，提示携带 WT p53 且 CAD 高表达的患者可能从谷氨酰胺拮抗剂治疗中获益。未来，进一步探究这些关键位点如何影响 p53 蛋白的整体结构和功能，有望为癌症治疗带来更多突破。
