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在基因功能研究中， pooled CRISPR 筛选虽重要，但后续命中验证至关重要。为解决此问题，研究人员开展基于 CRISPR 技术的命中验证研究，开发 CelFi 检测法。结果显示，该方法可验证筛选结果、评估基因依赖性等。这为基因功能研究及药物靶点发现提供有力工具。
在生命科学的探索旅程中，基因功能研究一直是核心热点。以往，高通量遗传筛选作为重要手段，为科研人员打开了了解细胞奥秘的大门。在这其中，Pooled CRISPR 筛选更是凭借强大的功能，在无偏差地探究基因功能、挖掘治疗靶点和揭示生物过程方面发挥着关键作用。它就像一把精准的 “基因手术刀”，能够在众多基因中找到与特定细胞过程相关的关键基因。比如，在癌症研究领域，科研人员利用它寻找癌细胞生存、生长依赖的基因，从而为开发新型抗癌药物奠定基础。
然而，这把 “手术刀” 并非完美无缺。Pooled CRISPR 筛选的结果存在诸多干扰因素，像基因拷贝数的差异、脱靶效应的影响、基因覆盖范围的局限、细胞生长速率的不同以及靶向效率的波动等。这些问题就像隐藏在暗处的 “敌人”，让筛选结果中混入了大量的假阳性和假阴性信息。这不仅增加了后续研究的难度，还可能导致科研人员在错误的方向上浪费大量时间和资源。所以，对 Pooled CRISPR 筛选得到的结果进行有效的验证，成为了基因功能研究道路上必须攻克的难题。
为了突破这一困境，来自圣犹大儿童研究医院（St. Jude Children’s Research Hospital）的研究人员挺身而出，展开了深入的研究。他们的目标明确，就是要开发一种简单、可靠且高效的方法，对 Pooled CRISPR 筛选得到的结果进行验证。经过不懈的努力，他们成功开发出了基于 CRISPR 技术的 CelFi（Cellular Fitness）检测法。这一成果意义重大，相关研究论文发表在《Scientific Reports》上。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。首先是细胞培养与转染技术，他们培养了多种细胞系，如 Nalm6、HCT116、DLD1 等，并通过核转染的方式将核糖核蛋白（RNPs）导入细胞，实现对目标基因的编辑。其次是深度测序技术，在不同时间点收集细胞，提取基因组 DNA 进行靶向深度测序，获取基因编辑后的插入缺失（indels）信息。此外，还利用了生物信息分析工具，如 CRIS.py 程序对测序数据进行分析，计算不同类型 indels 的比例，进而评估基因编辑对细胞适应性的影响 。
研究人员在探索过程中，取得了一系列重要的成果。
- CelFi 检测法可测量基因对细胞适应性的影响：CelFi 检测法的操作流程并不复杂。研究人员将由化脓链球菌（Streptococcus pyogenes）的 SpCas9 蛋白与靶向目标基因的单导向 RNA（sgRNA）组成的 RNPs 转染到细胞中。RNPs 会像 “基因剪刀” 一样精准地切割目标基因，导致 DNA 双链断裂。细胞自身会启动修复机制，主要是易错的非同源末端连接，这就会在断裂处产生 indels。由于大多数细胞系中每个目标基因有两个或更多拷贝，转染后的细胞群体就会包含不同 indels 类型的细胞。如果敲除目标基因会影响细胞的生长，那么含有功能缺失型 indels（通常是移码 indels，即 out-of-frame indels，OoF indels）的细胞数量就会随着时间发生变化。研究人员通过在转染后第 3、7、14 和 21 天收集细胞的基因组 DNA，进行靶向深度测序，并利用 CRIS.py 程序分析数据。在对 NUP54 和 RAN 等基因的研究中，发现当靶向 RAN 基因时，OoF indels 的比例在第 3 天到第 7 天急剧下降，到第 21 天几乎所剩无几，这与 DepMap 中 RAN 基因极低的 Chronos 评分相符，表明 CelFi 检测法能够准确反映基因对细胞适应性的影响。
- 评估细胞系特异性脆弱性：不同的基因对不同细胞系的生存影响各不相同。研究人员选取了六个在三个细胞系中 Chronos 评分存在差异的基因进行研究。通过 CelFi 检测法在不同细胞系中对这些基因进行检测并计算适应性比率，发现所有基因在预期的细胞系中都表现出适应性缺陷。但在对 SLC25A19 基因的研究中出现了意外情况，原本根据 Chronos 评分，它在 HCT116 和 DLD1 细胞系中不被认为是细胞生存必需基因，但 CelFi 检测法显示，用所有测试的 sgRNAs 靶向该基因时，三个细胞系都出现了适应性缺陷，这表明 SLC25A19 在原始的 Pooled CRISPR 筛选中可能是一个假阴性结果。
- sgRNA 活性对适应性比率的影响：为了探究 sgRNA 的活性是否会影响适应性比率，研究人员对靶向 POLR2B 基因的 RNPs 进行了稀释系列实验。结果发现，即使将 RNP 浓度稀释 32 倍，虽然总 indels 的百分比降低了，但适应性比率并没有显著变化。这一结果表明，CelFi 检测法对于评估低活性 sgRNA 或低转染效率的细胞系是一种可靠的工具。
- 基因拷贝数对适应性比率的影响：非整倍体现象在癌症和永生化细胞系中较为常见。研究人员推测目标基因拷贝数较高的细胞，在基因编辑后细胞适应性的降低幅度会较小。他们以 PPIL2 基因为研究对象，该基因在 Nalm6、U2OS 和 K562 细胞系中的 Chronos 评分相近，但拷贝数不同。实验结果显示，敲除 PPIL2 基因会对三个细胞系的细胞适应性产生负面影响，不过在拷贝数最高的 K562 细胞系中，这种影响相对较小。这说明基因拷贝数虽然会影响适应性比率，但不会改变细胞适应性缺陷的总体趋势。
- CelFi 检测法可用于研究药物治疗下基因对细胞适应性的影响：研究人员之前在 BCR-ABL+ B-ALL BV-173 细胞中进行了全基因组 Pooled CRISPR 筛选，发现了参与双氢青蒿素（DHA）介导的 MCL-1 抑制的基因。在本次研究中，他们利用 CelFi 检测法对 EIF2AK1 基因敲除后再进行 DHA 治疗的效果进行测试。结果显示，在正常情况下，EIF2AK1 对细胞适应性影响较小，在 DMSO 处理下 indel 谱保持稳定。但在 DHA 处理后，EIF2AK1 编辑的细胞群体中 0-bp indels 减少，OoF indels 增加，适应性比率大于 1.5，表明含有 EIF2AK1 敲除的细胞在 DHA 处理后具有生长优势，进一步证实了 DHA 杀死 BV-173 细胞是通过 EIF2AK1 基因产物起作用。
- CelFi 检测法可识别 Pooled CRISPR KO 筛选中的假阳性基因：研究人员在评估一些被报道为常见必需基因时，发现 OTOP1 可能是一个假阳性基因。在 HCT116 和 U2OS 细胞系中，用靶向 OTOP1 基因不同外显子的 sgRNAs 进行 CelFi 检测，结果显示三个 sgRNAs 的平均适应性比率都接近 1，表明 OTOP1 在这些细胞系背景下对细胞适应性影响可忽略不计。尽管 OTOP1 的 Chronos 评分在不同时间有所变化，但一直被列为常见必需基因，这再次凸显了对 CRISPR 筛选结果进行功能验证的重要性。
在讨论部分，研究人员指出，Pooled CRISPR 筛选是功能基因组学的重要工具，像 DepMap 这样的大规模筛选工作产生了海量有价值的数据。然而，筛选结果的数据分析、优先级排序以及高质量命中结果的识别至关重要，而命中结果的功能验证更是不可或缺。CelFi 检测法作为一种快速、稳健的基于 CRISPR 的方法，能够有效验证基因扰动对细胞适应性的影响。它通过跟踪目标基因的编辑结果，并将其与细胞群体中单个克隆的生长优势或劣势相关联，具有独特的优势。而且该检测法操作简单，能够在短时间内对任何可转染和培养的细胞系中的基因进行研究。在实验过程中，即使切割效率较低或基因拷贝数较高，CelFi 检测法也能有效验证命中结果。同时，它还能识别 Pooled CRISPR KO 筛选中的假阴性和假阳性结果，为后续研究提供更可靠的依据。不过，CelFi 检测法也存在一些局限性，比如受序列背景影响、存在 PCR 偏差、依赖靶向深度测序成本较高等。但研究人员针对这些问题提出了相应的解决措施，如优化 sgRNA 靶点选择、去除大的 indels、同时进行多个检测以降低成本等。
总的来说，CelFi 检测法为 Pooled CRISPR 筛选结果的验证提供了一种强有力的手段，极大地推动了基因功能研究的发展。它能够帮助科研人员更准确地识别真正的基因靶点，为开发新的治疗方法和药物提供了坚实的基础，在生命科学和健康医学领域具有广阔的应用前景。
