重组纳米颗粒疫苗：H5N1 2.3.4.4b 分支血凝素和神经氨酸酶激发免疫新希望

《Highly pathogenic avian influenza H5N1 clade 2.3.4.4b hemagglutinin and/or neuraminidase elicit immunity in a recombinant nanoparticle vaccine》一文，利用钴卟啉磷脂（CoPoP）脂质体展示重组 H5N1 2.3.4.4b 分支的 H5 和 N1 蛋白，制备纳米颗粒疫苗。该疫苗在小鼠实验中能诱导免疫反应，抵御致死性攻击，为防控 H5N1 高致病性禽流感（HPAI）提供新策略。

　　

研究背景

流感病毒是有包膜的单链负义 RNA 病毒，其表面的血凝素（hemagglutinin，HA）和神经氨酸酶（neuraminidase，NA）决定病毒亚型 。H5 和 H7 亚型的高致病性禽流感（highly pathogenic avian influenza，HPAI）感染性和致病性强。1997 年首次出现 H5N1 感染人类病例，此后 H5N1 HPAI 在多地传播。

H5N1 HPAI 根据 H5 基因进化分为不同遗传分支，2021 年以来，H5N1 clade 2.3.4.4b 在禽类、野生鸟类、家禽及奶牛中广泛传播，还出现人类感染病例，部分感染较为严重，且多种哺乳动物可能成为病毒传播给人类的中间宿主，因此急需加强监测和防控措施。

目前针对 H5N1 已有多种疫苗，但美国食品药品监督管理局（FDA）批准的疫苗并非针对 H5N1 clade 2.3.4.4b，其免疫效果存疑。传统基于鸡蛋生产的疫苗存在生产周期长、易受鸡蛋短缺影响等问题，且对 NA 含量控制不明确。重组病毒载体疫苗、mRNA 疫苗虽有进展，但仍需优化。重组蛋白疫苗因生产快速、可规模化且免疫原性强、副作用小等优势备受关注，纳米颗粒形式的流感蛋白疫苗能进一步提高免疫原性。

研究团队此前开发了基于 CoPoP 脂质体的疫苗平台，可展示重组蛋白抗原，且在 SARS-CoV-2 RBD 疫苗的 3 期临床试验中展现出良好安全性和免疫原性。本研究旨在评估以 CoPoP 脂质体为载体，展示 H5N1 clade 2.3.4.4b 的 H5 和 N1 蛋白的疫苗在小鼠中的免疫效果。

实验设计

1. 疫苗制备：将 H5N1 clade 2.3.4.4b（A/Jiangsu/NJ210/2023）的 H5 和 N1 蛋白分别与包含 CoPoP、PHAD-3D6A 和 QS-21 的免疫原性脂质体（CPQ）混合，制备单价或二价疫苗。N1 蛋白含 N 端组氨酸标签（his-tag）和血管扩张刺激磷蛋白（vasodilator-stimulated phosphoprotein，VASP）四聚化结构域，H5 蛋白去除多碱性切割位点，含 C 端 his-tag 和纤维蛋白三聚化结构域。
2. 实验动物分组：选用 ICR 小鼠和 BALB/c 小鼠进行实验。ICR 小鼠分组接受不同疫苗免疫，包括 CPQ H5、CPQ N1、CPQ H5 + N1，同时设置对照组。BALB/c 小鼠也分为相应疫苗免疫组和 PBS 对照组，部分小鼠在免疫后用高致病性的 A/Red Tailed Hawk/ON/FAV-0473-4/2022（RTH/2022） 2.3.4.4b 毒株进行攻毒实验。
3. 检测指标：检测疫苗中 H5 和 N1 蛋白与 CPQ 脂质体的结合情况、免疫后小鼠血清中针对 H5 和 N1 的特异性免疫球蛋白 G（IgG）滴度、病毒中和滴度（virus neutralization titers，NTs）、血凝抑制（hemagglutination inhibition，HAI）滴度、神经氨酸酶抑制（neuraminidase inhibition，NAI）滴度，以及脾细胞分泌干扰素 -γ（interferon-γ，IFN-γ）的水平。攻毒后观察小鼠的生存情况、体重变化，并检测肺部病毒载量。

实验结果

1. 蛋白与脂质体结合：H5 和 N1 蛋白能自发且高效地与 CPQ 脂质体结合，形成稳定的纳米脂质体结合形式，且结合后的蛋白仍能被相应单克隆抗体识别，表明其抗原表位可及。制备的疫苗粒径约 110nm。
2. 免疫反应：免疫 ICR 小鼠后，ELISA 检测显示，单价和二价疫苗均能诱导产生针对 H5 和 N1 的特异性 IgG 抗体。CPQ H5 和 CPQ H5 + N1 疫苗诱导的病毒中和滴度较高，能有效中和 RTH/2022 毒株。CPQ N1 和 CPQ H5 + N1 疫苗诱导的抗 NA 滴度较强。HAI 检测中，CPQ H5 和 CPQ H5 + N1 疫苗诱导的抗体针对病毒受体结合位点的抑制作用相对较弱，可能与产生的抗体主要靶向 HA 茎部有关。

与其他常见流感疫苗佐剂（AddaVax、AS01、明矾）相比，CPQ 佐剂能诱导更高水平的抗原特异性 IgG、中和抗体滴度、HAI 滴度，以及更多的 IFN-γ 分泌，表明 CPQ 佐剂的免疫增强效果更优。

在 BALB/c 小鼠实验中，CPQ H5 和 CPQ H5 + N1 疫苗诱导的针对 A/Astrakhan/3212/2020 H5 的 IgG 抗体滴度较高，且加强免疫后滴度显著提升。虽然二价疫苗诱导的 H5 抗体水平更高，但 CPQ H5 和 CPQ H5 + N1 疫苗的中和抗体水平无明显差异。3. 疫苗保护效果：用 RTH/2022 毒株攻毒后，CPQ H5 和 CPQ H5 + N1 免疫组小鼠完全存活，CPQ N1 免疫组 70% 的小鼠存活，而 PBS 对照组小鼠死亡率高。CPQ H5 和 CPQ H5 + N1 免疫组小鼠肺部病毒载量低，CPQ N1 免疫组部分小鼠肺部可检测到病毒，表明疫苗能有效保护小鼠抵抗病毒感染，且 HA 在保护中起关键作用，但 NA 抗体和细胞免疫反应与保护效果的关系需进一步研究。

研究讨论

本研究开发的基于 CoPoP 脂质体展示重组 H5 和 N1 蛋白的纳米颗粒疫苗，在小鼠实验中诱导了强大的体液和细胞免疫反应，有效保护小鼠免受 H5N1 clade 2.3.4.4b 毒株的致死性攻击。HA 在疫苗保护中至关重要，但单独使用 NA 作为疫苗抗原也能提供一定保护，联合 HA 和 NA 可能产生更有效的互补免疫反应，不过本研究未评估疫苗的保护广度。

研究存在一定局限性，如仅使用小鼠模型，未来应考虑使用雪貂等更接近人类感染情况的动物模型；未优化佐剂配方和剂量，也未设置基准疫苗进行对比。总体而言，CPQ 系统为未来流感病毒疫苗开发提供了有前景的策略，纳米颗粒疫苗靶向 H5、N1 或二者组合是可行的疫苗开发方向。