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Usutu 病毒（USUV）严重影响鸟类和人类健康。为探究其与宿主细胞的相互作用机制，研究人员开展了关于 USUV NS4A 蛋白的研究。结果发现，USUV NS4A 诱导自噬，且被 p62/SQSTM1 靶向降解，这揭示了宿主抗病毒防御的新机制，为防控 USUV 感染提供新方向。
在神秘的病毒世界里，Usutu 病毒（USUV）就像一个隐藏的威胁。它起源于非洲，如今已在欧洲多国 “安营扎寨”，还时不时 “攻击” 鸟类和人类。这个病毒的基因组虽小，仅由约 11kb 的正链单股 RNA 构成，却能编码 3 种结构蛋白和 7 种非结构蛋白（NS 蛋白）。这些蛋白在病毒的感染、复制和传播过程中起着至关重要的作用，同时也与宿主细胞展开了一场复杂的 “攻防战”。
目前，人们对 USUV 与宿主细胞的相互作用机制知之甚少，这就像在黑暗中摸索，找不到方向。为了照亮这片黑暗，来自荷兰莱顿大学医学中心（Leiden University Medical Center）的研究人员挺身而出，决心揭开 USUV 的神秘面纱。他们将目光聚焦在 USUV 的 NS4A 蛋白上，这个跨膜蛋白主要定位于内质网（ER），其功能却一直是个谜。研究人员推测，NS4A 蛋白可能在病毒与宿主的相互作用中扮演着关键角色，于是一场围绕 NS4A 蛋白的研究之旅就此展开。
经过不懈努力，研究人员取得了一系列重要成果，这些成果发表在《Virology Journal》上，为我们认识 USUV 提供了新的视角。
研究人员开展研究时，用到了几个主要关键技术方法。首先是邻近标记耦合质谱技术，通过将生物素连接酶 TurboID 与 NS4A 融合，标记与 NS4A 相互作用的蛋白，进而鉴定其相互作用组；其次运用了多种细胞实验技术，如细胞转染、免疫荧光、免疫沉淀、Western blotting 等，用于检测蛋白表达、定位及相互作用；此外，还通过 RNA 干扰（RNAi）技术敲低 p62 表达，探究其对病毒复制的影响；最后利用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）检测病毒 RNA 和宿主基因表达水平。
下面来看看具体的研究结果。
- Mapping the USUV NS4A interactome：研究人员运用邻近标记耦合质谱技术，在 293T 细胞中探究 USUV NS4A 的相互作用蛋白。他们共鉴定出 391 个在 NS4A - TurboID 和 TurboID - NS4A 转染细胞中显著富集的蛋白。基因本体富集分析显示，这些相互作用蛋白在蛋白质结合、细胞内运输、细胞器组织和自噬等生物学过程中显著富集。这表明 USUV NS4A 可能与细胞的自噬反应存在密切联系。
- USUV infection and NS4A overexpression induce autophagosomes：基于上述发现，研究人员进一步研究 USUV 感染和 NS4A 过表达对自噬的影响。通过免疫荧光和 Western blot 分析，他们发现 USUV 感染 Huh7 细胞后，细胞内 LC3 - Ⅱ 水平升高，LC3 斑点数量增多，这意味着自噬体被诱导形成。同时，单独表达 USUV NS4A 和其他非结构蛋白也能诱导自噬体形成，且用巴氟霉素 A1（BafA1）处理后，LC3 - Ⅱ 水平进一步上升，说明这些蛋白的过表达激活了完整的自噬通量，即 NS4A 可以诱导自噬通路。
- The canonical autophagy pathway does not influence USUV replication：接下来，研究人员想知道自噬通路的诱导是否会影响 USUV 的复制。他们使用雷帕霉素（rapamycin）诱导自噬，渥曼青霉素（wortmannin）和巴氟霉素 A1 抑制自噬的不同阶段，然后感染 A549 细胞、Huh7 细胞和小鼠胚胎成纤维细胞（MEFs）。结果发现，除了雷帕霉素处理 MEFs 导致 USUV 滴度略有降低（但同时细胞活力下降，可能是毒性作用导致）外，雷帕霉素和渥曼青霉素对 USUV 复制均无显著影响。巴氟霉素 A1 虽使 USUV 滴度大幅下降，但这更可能与溶酶体降解途径的其他部分有关，而非自噬通路。此外，敲除不同自噬相关基因（ATG3、ATG5、ATG13）的细胞系感染实验表明，自噬总体上对 USUV 复制无显著影响，但自噬通路的不同部分可能在 USUV 感染中发挥不同作用。
- P62/SQSTM1 interacts with NS4A and targets NS4A for degradation：在 NS4A 的相互作用蛋白中，研究人员注意到了自噬相关的货物受体 p62/SQSTM1。通过共免疫沉淀实验，他们证实了 p62 与 USUV NS4A 之间的相互作用。进一步研究发现，自噬能促进 NS4A 的降解，过表达 p62 会使 NS4A 水平呈剂量依赖性下降，敲低 p62 则会使 NS4A 水平升高。而且，缺乏与 LC3 结合能力的 p62 突变体（ΔLIR）不能降低 NS4A 水平，这表明 p62 通过自噬通路靶向 NS4A 进行降解。
- P62/SQSTM1 acts as an antiviral factor during USUV infection：最后，研究人员探究了 p62 在 USUV 复制中的作用。他们用靶向 p62 的小干扰 RNA（siRNA）转染 A549 细胞，然后感染 USUV。结果显示，敲低 p62 后，细胞内 USUV RNA 水平显著升高，这表明 p62 在 USUV 感染中起到抗病毒作用。此外，敲低 p62 后，细胞中干扰素 -β（IFN-β）水平升高，但干扰素刺激基因（ISG）IFIT2 表达仅略有增加，ISG15 水平甚至下调，这表明 p62 可能通过多种途径影响 USUV 复制，其抗病毒功能可能不仅仅依赖于自噬通路。
综合研究结论和讨论部分，这项研究意义重大。研究表明，USUV 感染和 NS4A 过表达均可诱导自噬，但经典自噬通路整体上似乎并不影响 USUV 复制。然而，USUV NS4A 可被 p62 介导的选择性自噬靶向降解，这揭示了宿主对抗 USUV 的一种潜在新机制。同时，p62 在 USUV 感染中发挥抗病毒作用，其机制可能涉及多个途径。这一研究为深入理解 USUV 与宿主细胞的相互作用提供了重要依据，为开发针对 USUV 感染的防控策略开辟了新方向，有望在未来帮助我们更好地应对 USUV 带来的健康威胁。
