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为探究炎症诱导克罗恩病（CD）肠纤维化的机制，南京医科大学研究人员对 CD 单细胞图谱再分析，并构建小鼠模型研究。结果发现 TGF-β 通过激活 Smad3 刺激 Tregs 和人肠肌成纤维细胞（MFs）表达 AREG，促进肠纤维化。这为 CD 肠纤维化治疗提供新靶点123。
在肠道的微观世界里，克罗恩病（Crohn’s disease，CD）正悄然引发一场 “风暴”。CD 作为一种慢性、持续性的肠道炎症性疾病，常常导致肠壁全层组织受损。而肠纤维化，作为 CD 常见且严重的并发症，如同肠道的 “疤痕”，严重影响着患者的生活质量。据估计，超过 50% 的 CD 患者在一生中会出现临床上明显的纤维狭窄性病变。目前，常规的抗炎疗法对狭窄性疾病进展的缓解效果有限，也缺乏有效的抗纤维化或抗狭窄治疗方法，手术或内镜干预仍是主要的治疗手段。在这样的背景下，探究 CD 肠纤维化的发病机制迫在眉睫，这不仅有助于深入理解疾病的发展过程，更为寻找新的治疗靶点带来希望。
为了揭开 CD 肠纤维化的神秘面纱，南京医科大学第一附属医院的研究人员展开了深入研究。他们利用 Dr. Florian Rieder 提供的 CD 全层单细胞图谱进行重新分析，并构建了多种小鼠模型，包括 DSS 诱导的慢性结肠炎模型、CD45RBhi CD4+ T 细胞过继转移模型等。同时，对人肠道组织样本和细胞进行研究，综合运用多种实验技术，最终揭示了重要的分子机制，研究成果发表于《Journal of Translational Medicine》。
研究人员在开展研究时，主要运用了以下几种关键技术方法：一是单细胞 RNA 测序（scRNAseq）技术，获取了 CD 患者肠道组织的单细胞转录图谱，分析不同细胞类型的表达差异；二是构建小鼠疾病模型，如 DSS 诱导的慢性结肠炎模型，模拟肠道炎症和纤维化过程；三是细胞培养和转染技术，用于体外研究细胞的功能和分子机制；四是组织病理学分析，通过 H&E 染色、Masson 染色等方法，评估肠道炎症和纤维化程度。
研究结果如下：
- 单细胞图谱揭示 Treg 细胞的潜在作用：通过对 CD 全层单细胞图谱分析，研究人员发现 T 细胞在 CD 肠道炎症的发病机制中起重要作用。在 T 细胞中，调节性 T 细胞（Tregs）在狭窄性 CD 的狭窄组织中占比更大且数量显著增加，这表明 Tregs 可能在 CD 肠纤维化中发挥关键作用。
- Treg 细胞产生高水平的 AREG：研究人员发现 Tregs 产生高水平的双调蛋白（AREG），且 AREG 不影响 Tregs 的分化。实验中，通过对不同极化条件下的 CD4+ T 细胞进行培养，利用 qRT-PCR 检测 Areg 的表达，结果显示 Tregs 中 Areg 的表达水平与 Th17 细胞相当。
- AREG 缺乏减轻肠纤维化：建立 DSS 诱导的慢性结肠炎模型后发现，Areg-/-小鼠虽然表现出更严重的结肠炎，但肠纤维化程度较轻。通过 Masson 染色、qRT-PCR、western blot 等实验检测发现，Areg-/-小鼠结肠中胶原蛋白表达减少，α- 平滑肌肌动蛋白（α-SMA）表达和 α-SMA 层厚度降低，这表明 AREG 促进肠纤维化。
- Areg-/- Treg 细胞诱导较轻的肠纤维化：利用 CD45RBhi CD4+ T 细胞过继转移模型研究发现，Areg-/- Tregs 诱导的肠纤维化程度比野生型（WT）Tregs 更轻，说明 AREG 促进 Tregs 诱导的肠纤维化，且该过程独立于炎症。
- TGF-β 通过激活 Smad3 促进 Treg 细胞中 AREG 的表达：研究发现 TGF-β 通过激活 Smad3 促进 Tregs 分泌 AREG。实验中，用 TGF-β、IL-2、IL-10 等细胞因子处理 CD4+ T 细胞，结果显示只有 TGF-β 能诱导 AREG 蛋白和 mRNA 表达增加，且呈时间和浓度依赖性。同时，添加 TGF-β 受体抑制剂或 Smad3 抑制剂后，Areg 表达受到抑制。
- Treg 细胞来源的 AREG 促进肠肌成纤维细胞的激活和增殖：AREG 能够促进人肠肌成纤维细胞（MFs）的增殖和迁移。通过免疫荧光染色、伤口愈合实验、共培养实验等发现，AREG 处理的 MFs 中 Ki67 阳性细胞比例增加，伤口愈合速度加快，与 WT Tregs 共培养的 MFs 增殖和迁移能力更强，且 α-SMA 和胶原蛋白相关基因的表达增加。
- TGF-β 通过激活 Smad3 促进人肠肌成纤维细胞中 AREG 的表达：TGF-β 能直接作用于人肠 MFs，促进 AREG 表达。实验显示，TGF-β 处理的 MFs 中 AREG 表达升高，且 Smad3 磷酸化水平增加，添加 Smad3 抑制剂后，AREG 表达和 α-SMA、COL1A1 等基因的表达均降低。
- AREG 和 TGF-β 在 CD 患者纤维化部位增加：对 CD 患者的研究发现，有肠纤维化的患者外周血中 Areg+ Tregs 的比例更高，且纤维化部位的 AREG 和 TGF-β 表达水平高于非纤维化部位，两者表达呈正相关。
研究结论和讨论部分指出，Tregs 在 CD 肠纤维化的发病机制中具有重要作用。TGF-β 诱导 Tregs 和人肠 MFs 分泌 AREG，AREG 促进 MFs 的增殖、迁移和胶原蛋白表达，进而促进肠纤维化。Areg-/-小鼠和 Areg-/- Tregs 的实验结果进一步证实了 AREG 在肠纤维化中的关键作用。此外，研究还发现 TGF-β 通过激活 Smad3 促进 AREG 表达，这为干预 CD 肠纤维化提供了潜在的治疗靶点。这项研究为深入理解 CD 肠纤维化的发病机制提供了新的视角，也为开发针对 CD 肠纤维化的新型治疗策略奠定了基础，有望为众多 CD 患者带来新的希望，改善他们的生活质量，减轻疾病负担。
