信号序列在细菌微区室形成中的关键作用及代谢工程应用意义

本文聚焦细菌微区室（MCPs），研究信号序列在 1,2 - 丙二醇利用（Pdu）MCP 组装中的作用。鉴定出结构蛋白上的新信号序列，通过敲除实验揭示其对 MCP 组装的影响，为 MCPs 工程化应用提供策略，助力代谢工程发展。

　　

研究背景

生物制造是一种可持续合成化学品的方法，但代谢工程面临诸多挑战，如通量不平衡和脱靶产物形成等。细菌微区室（MCPs）作为一种空间组织策略，可封装代谢途径，为解决这些问题提供了可能。MCPs 是蛋白质细胞器，由半透性多面体外壳包裹液态酶核心组成，包括羧酶体和代谢体。1,2 - 丙二醇利用（Pdu）MCP 是研究较多的代谢体，能将 1,2 - 丙二醇转化为丙酸和 1 - 丙醇，相关蛋白由 pdu 操纵子表达。

近年来，利用基于 Pdu MCP 外壳的工程自组装结构来组织异源途径的研究增多，但对 MCP 组装和功能的影响尚不清楚。一些 MCP 货物蛋白含靶向酶核心的信号序列，部分 Pdu MCP 酶的信号序列已被鉴定，它们共享特定结构和基序，但在封装效率上存在差异。本研究旨在探究信号序列在 MCP 形成和结构中的作用，为工程化改造 MCPs 提供设计规则。

实验结果

1. 新信号序列的鉴定：通过搜索 Pdu 蛋白中未识别的信号序列基序，发现 PduM 和 PduB 的 N 端延伸可作为信号序列，而 PduE 的 N 端延伸不是功能性信号序列。PduM 的 N 端与已知信号序列相似，经 HHpred 程序分析及实验验证，其 N 端的 PduM^1-23足以将蛋白靶向 Pdu MCP 核心，且是 PduM 封装所必需的。PduB 的 N 端虽不完全符合信号序列模式，但预测可折叠成类似结构，实验表明 PduB^1-22和 PduB^1-37可将异源货物靶向 MCPs，不过与其他信号序列相比，其与 MCPs 的相互作用较弱。同时，评估了这些信号序列的封装效率，发现 ssPduD - GFP、ssPduP - GFP 和 ssPduM - GFP 的封装效率较高，而 ssPduL - GFP、ssPduB - GFP 和 ssPduE - GFP 较低。
2. 信号序列突变对封装效率的影响：由于 Pdu 信号序列的封装效率差异与氨基酸序列和预测结构无明显关联，研究人员对弱 / 非功能性信号序列 ssPduL 和 ssPduE 的特定区域进行突变，以探究是否能改变其封装效率。设计并表达了六个突变信号序列，结果显示突变可增加部分序列的封装效率，但效果并不一致，表明蛋白折叠和功能之间的关系敏感且不可预测。
3. 酶促信号序列在 MCP 形成中的作用：为研究酶促信号序列对 MCP 组装的影响，敲除了编码 ssPduD、ssPduP 和 ssPduL 的序列。荧光显微镜和透射电子显微镜（TEM）结果显示，敲除这些信号序列会减少 MCP 核心和外壳的形成，使荧光 puncta 数量减少，且 ssPduD 的缺失对 MCP 形成影响最大。过表达 ssPduD - GFP 可部分挽救因敲除 ssPduD 导致的组装缺陷，而 ssPduP - GFP 和 ssPduL - GFP 的互补作用不明显，表明 ssPduD 在 Pdu MCP 组装中具有独特作用。TEM 还显示，敲除信号序列会使 MCP 形态发生变化，如部分 MCP 形状不规则、尺寸改变等。
4. 结构信号序列对 MCP 功能的影响：敲除结构信号序列 ssPduM 和 ssPduB 后发现，其导致的组装缺陷与敲除全长 pduM 和 pduB 相似，会使 MCP 核心和外壳部分或完全分离，且过表达敲除的信号序列无法挽救组装缺陷。这表明这些缺陷是由于 PduM 和 PduB 蛋白主体与 MCP 核心断开连接所致。TEM 显示，敲除结构信号序列会影响 MCP 的大小和电子密度，如部分 MCP 尺寸增大或减小，内部电子密度降低等。
5. 酶促与结构信号序列同时敲除的影响：同时敲除酶促和结构信号序列后，发现结构信号序列敲除导致的结构缺陷占主导，但同时敲除会进一步减少 MCP 外壳的形成。荧光显微镜观察到核心报告蛋白主要定位于极体，且 PduA - GFP 的 puncta 数量显著减少。TEM 显示，部分菌株的 MCP 没有完整的外壳，表明同时敲除会破坏 MCP 外壳的形成。

讨论

本研究通过对 Pdu 信号序列的研究，为代谢工程中 MCPs 的应用提供了重要信息。鉴定出的结构蛋白上的新信号序列，表明分析预测的 MCP 蛋白结构是识别潜在信号序列的有效方法，且封装肽活性与蛋白折叠方式有关。信号序列在 MCP 组装中具有重要作用，酶促信号序列影响 MCP 的整体形成，结构信号序列则主要负责连接 MCP 核心和外壳。研究结果还提供了设计规则，在将异源途径封装到 MCPs 中时，应保留 ssPduD 等酶促信号序列，同时确保 PduM 和 PduB 及其信号序列的完整性，以减少对 MCP 组装的干扰，推动 MCPs 在代谢工程中的应用。