OXA-48 样碳青霉烯酶产生菌药敏测试大揭秘：多种方法大比拼，关乎治疗与防控！

推荐阅读！本文对比研究了纸片扩散法（DD）、梯度测试（ETEST）和 VITEK 2 等与参考肉汤微量稀释法（BMD）检测 OXA-48 样碳青霉烯酶产生肠杆菌科细菌（CPE）对碳青霉烯类药物敏感性的性能差异，为临床合理用药和感染防控提供重要参考。

　　### 研究背景
碳青霉烯酶产生肠杆菌科细菌（CPE）对全球医疗健康构成严重威胁，其携带的碳青霉烯酶编码基因常位于质粒上，传播性强，给患者管理带来巨大负担。在西欧，OXA-48 样碳青霉烯酶最为常见，因其水解活性弱，细菌对碳青霉烯类药物的最低抑菌浓度（MIC）仅略有升高，易被误判为敏感，且缺乏有效的表型抑制剂测试方法，给检测带来挑战。准确测定碳青霉烯类药物的 MIC 对选择最佳治疗方案和检测碳青霉烯酶至关重要，然而现有衍生药敏测试方法对 OXA-48 样分离株的性能尚不清楚。

材料和方法

1. 研究设计与临床分离株：本研究为实验室对比研究，收集了 2012 - 2021 年来自科隆大学医院和奥尔登堡医院的 249 株非重复临床分离株，包括 107 株 OXA-48 样 CPE 和 142 株不产生任何类型碳青霉烯酶的对照菌株。所有分离株均经全基因组测序进行分子特征分析，来源于多种临床样本，储存于 - 80°C，测试前在 5% 羊血琼脂上进行两次传代培养，并通过基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）进行鉴定。
2. 药敏测试（AST）：所有测试均使用 0.5 麦氏浊度的菌悬液，依据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会（EUCAST）临床断点（v14.0）进行结果判读。纸片扩散法（DD）、梯度测试（ETEST）按照制造商指南进行目视读取，研究者对分离株分子特征不知情。同时使用大肠埃希菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）和肺炎克雷伯菌（ATCC 700603、ATCC BAA-2814）作为质量控制菌株。若参考方法与衍生方法结果存在差异（MIC 法差异 > 2 个稀释度或 DD 法存在分类差异），则重新测试以排除技术误差。
3. 肉汤微量稀释法（BMD）：采用定制的 BMD 检测试剂盒（Micronaut-S, Bruker Daltonics），在 36°C 孵育 18 - 24 h 后，用倒置镜目视读取结果。
4. 纸片扩散法（DD）：依据 EUCAST 标准，在 Mueller-Hinton 琼脂（MHA）上使用 10 μg 美罗培南、10 μg 厄他培南和 10 μg 亚胺培南纸片进行测试，所有试剂均购自 Oxoid 公司。
5. 梯度测试（ETEST）：将碳青霉烯类梯度测试条（ETEST, bioMérieux）放置在接种有细菌悬液的 MHA 上，36°C 孵育 18 - 20 h 后读取结果。
6. VITEK 2 系统：使用 AST-N223、AST-N428 和 AST-N432 卡片（bioMérieux），按照制造商推荐及 VITEK 2 软件 v9.03 进行测试。部分分离株生长不规则无法获得 MIC 值，且 AST-N223 卡片在重新测试时停产，导致部分分离株无法用该卡片评估。
7. 全基因组测序（WGS）：使用 DNeasy UltraClean Microbial Kit（Qiagen）提取 DNA，在 Illumina 平台对所有分离株进行 WGS。原始读数通过 Spades v3.14.1 进行从头组装，利用 ResFinder 数据库和 ABRicate 1.0.1 确定耐药基因内容。
8. 统计分析：以 BMD 为参考方法，依据 ISO 指南评估基本一致率（EA）、分类一致率（CA）、主要错误（ME）、极主要错误（VME）和偏差。采用 Mann-Whitney U 检验和 Pearson's χ2 检验进行统计比较，P < 0.05 为差异有统计学意义。

研究结果

1. 分离株特征：OXA-48 样 CPE 中 69.2% 携带额外的超广谱 β- 内酰胺酶（ESBL）基因，对照菌株存在其他耐药机制，135/142 株至少对一种碳青霉烯类药物的 MIC 高于 EUCAST 筛选临界值。
2. 耐药频率：在 OXA-48 样组中，BMD 测定的厄他培南、亚胺培南和美罗培南耐药频率分别为 86.9%、12.1% 和 10.3%。与参考方法相比，除 ETEST 检测厄他培南、VITEK 2 AST-N428 检测亚胺培南和 VITEK 2 AST-N432 检测美罗培南外，其他衍生方法倾向于高估耐药性。仅 DD 检测 OXA-48 样组中亚胺培南的耐药频率存在显著差异（P < 0.05）。
3. MIC 值差异：不同测试方法测定的 MIC₅₀/MIC₉₀值与 BMD 相比存在显著差异。在 OXA-48 样组中，所有 VITEK 2 卡片检测厄他培南和美罗培南的 MIC 值均显著高于 BMD；在对照组中，VITEK 2 AST-N223 和 VITEK 2 AST-N432 检测厄他培南的 MIC 值显著高于 BMD。
4. 一致性评估：在 OXA-48 样组和对照组中，大多数方法检测碳青霉烯类药物的 EA<90%。OXA-48 样组中，ETEST 检测美罗培南的 EA 最高（93.5%），其次为厄他培南（92.5%），所有 VITEK 2 卡片的 EA 均 < 90%；亚胺培南则以 VITEK 2 AST-N428 的 EA 最高（90.5%）。多数 VITEK 卡片检测 OXA-48 样组中厄他培南和美罗培南的偏差> 30%，提示倾向于高估 MIC。
5. 分类一致率（CA）：OXA-48 样组中，厄他培南的 CA 在所有方法中均较高（93.5% - 98.1%），高于亚胺培南（59.8% - 81.4%）和美罗培南（78.8% - 95.3%）。ETEST 检测厄他培南和美罗培南的 CA 最高，VITEK 2 AST-N223 检测亚胺培南的 CA 最高。厄他培南的 ME 频率最高（21.4% - 50.0%），VITEK 2 AST-N428 检测亚胺培南时观察到 7.7% 的 VME，两组中均未记录到美罗培南的 ME 或 VME。
6. EUCAST 筛选临界值评估：基于美罗培南和厄他培南的 EUCAST 筛选临界值检测假定的 OXA-48 样碳青霉烯酶产生菌具有高敏感性，但特异性较低。部分 CPE 分离株的 MIC 低于筛选临界值，如 3 株大肠埃希菌的美罗培南 MIC 为 0.125 mg/L，2 株奇异变形杆菌的厄他培南 MIC 为 0.06 mg/L。新的 VITEK 2 AST 卡片（AST-N428 和 AST-N432）对厄他培南的 MIC 检测范围更低，有助于更准确的 AST 结果和应用筛选临界值。

讨论

1. 方法性能差异：本研究对比多种方法检测 OXA-48 样和对照组分离株对碳青霉烯类药物的敏感性，发现衍生测试方法在耐药性、MIC、EA、CA、错误频率和偏差等方面存在显著差异。ETEST 检测厄他培南和美罗培南、VITEK 2 AST-N428 检测亚胺培南时达到了 ISO 标准的可接受 EA，但多数方法对亚胺培南的 CA 不理想，提示需要替代方法确保准确检测 OXA-48 样 CPE 对亚胺培南的敏感性。
2. 临床意义：可靠的 MIC 测定对临床治疗决策至关重要，不准确的结果可能导致错过使用含碳青霉烯类药物的治疗方案或使用不恰当的治疗。例如，对于美罗培南 MIC≤8 mg/L 的菌株，衍生方法可能因高估耐药性而影响治疗。若临床考虑使用含碳青霉烯类药物的方案，建议用第二种方法（如 BMD）重新检测 MIC。
3. 错误频率影响：ME 和 VME 与患者不良预后相关，不同研究中商业方法在检测 KPC 产生菌、MBL 产生菌和 OXA-48 样产生菌时的 ME 和 VME 频率存在差异，可能与研究中分离株数量、测试材料和方法不同有关。
4. 筛选临界值的局限性：EUCAST 筛选临界值检测碳青霉烯酶的敏感性高但特异性低，部分 OXA-48 样产生菌的碳青霉烯类药物 MIC 低于筛选临界值但高于流行病学临界值（ECOFF），应用物种特异性筛选临界值可能提高检测敏感性。本研究中对照组分离株因具有多种耐药机制，影响了筛选临界值的特异性，且部分自动化系统无法应用筛选临界值，新的 VITEK 2 AST 卡片在这方面有所改进。
5. 研究局限性：本研究存在一定局限性，如使用商业 BMD 检测作为金标准、每种方法仅对每个分离株测试一次、仅由一名阅读者读