Cathelicidin 抗菌肽：有袋类新生儿免疫保护的关键 “卫士”

为探究有袋类新生儿免疫保护机制，研究人员以蜜袋鼯（Petaurus breviceps）为模型开展研究。结果发现 Cathelicidins 在有袋类新生儿免疫中起关键作用，其表达受调控且功能多样。该研究为理解有袋类免疫提供依据，具有重要意义。

　　在奇妙的动物世界里，哺乳动物的幼崽出生后就面临着一个充满微生物的环境。对于大多数哺乳动物来说，这是一个挑战，但不同种类的哺乳动物应对挑战的方式各不相同。比如，像牛和豚鼠这样的早熟哺乳动物，出生时就配备了大部分关键的免疫组件，能够迅速对病原体做出反应；而像小鼠和大鼠这类晚熟哺乳动物，由于妊娠期短，出生时免疫系统发育较差，需要更多的母性照顾。

有袋类动物在哺乳动物中更是一个特殊的存在。它们大约在 1.6 亿年前与真兽类动物分化，有着独特的生殖和形态特征。雌性有袋类动物妊娠期短，生下的幼崽高度未成熟，需要在育儿袋中完成身体发育。这就导致有袋类新生儿的免疫系统存在诸多缺陷，比如造血位点仍在肝脏，缺乏胸腺和淋巴结等淋巴器官，无法产生适应性免疫反应。而育儿袋又与外界环境接触，充满了各种细菌，包括许多致病菌，这对有袋类新生儿的生存构成了巨大威胁。尽管有袋类新生儿可以通过母体获得一定的保护，如通过乳汁获得免疫球蛋白，育儿袋腺体分泌抗菌化合物等，但目前我们对有袋类新生儿自身的免疫保护机制知之甚少。此前的研究大多依赖野生动物，难以获取准确时间的样本和进行对照实验，而且合适抗体的稀缺也阻碍了相关研究的进展。

为了深入了解有袋类新生儿的免疫保护机制，来自普林斯顿大学的研究人员以蜜袋鼯为研究模型，开展了一系列研究。该研究成果发表在《SCIENCE ADVANCES》上，具有重要的科学意义。

研究人员运用了多种关键技术方法。首先是单细胞 RNA 测序（scRNA-seq），通过对出生当天（产后第 0 天，P0）蜜袋鼯肝脏进行单细胞 RNA 测序，分析细胞类型组成和基因表达情况。其次是染色质可及性测序（ATAC-seq），用于识别开放染色质区域和潜在的顺式调控元件（CREs）。还有 Region Capture Micro-C（RCMC）技术，这是一种染色体构象捕获技术，能够高分辨率检测基因组位点之间的相互作用。另外，研究人员还进行了体外和体内实验，如肉汤微量稀释抗菌试验、细胞活力测定、体内小鼠感染实验等，以探究蜜袋鼯 Cathelicidins 的功能。

下面来看具体的研究结果：

1. 蜜袋鼯新生儿肝脏中中性粒细胞是最丰富的免疫细胞：研究人员对 P0 蜜袋鼯肝脏进行 scRNA-seq，检测到 6028 个细胞，分为 16 个簇。分析发现中性粒细胞谱系细胞（包括中性粒细胞、未成熟中性粒细胞、前中性粒细胞和粒细胞单核细胞祖细胞）是最丰富的细胞类型，占整个细胞群体的 48.4%。此外，还鉴定出少量的淋巴样细胞群体，这与之前的报道有所不同。通过组织学分析，进一步证实了造血过程发生在新生儿肝脏中。这表明蜜袋鼯在新生儿期高度依赖中性粒细胞进行免疫保护。
2. Cathelicidins 在有袋类中性粒细胞中高表达：由于发育中的中性粒细胞在蜜袋鼯新生儿造血组织中占比最多，研究人员对其进行了差异表达分析。结果发现，在中性粒细胞谱系细胞中，有三个 Cathelicidin 抗菌肽（Camps）基因（LOC11021700、LOC110217149和LOC110217150）在差异表达基因中位居前列，其中LOC11021700的上调程度最高。研究人员在蜜袋鼯基因组中鉴定出 10 个 Camp 基因（Camp1 - Camp10）和Ngp基因，它们位于两个基因组簇中。大多数 Cathelicidin 基因在中性粒细胞谱系细胞中特异性表达，且不同基因的表达水平存在差异。通过纵向批量 RNA-seq 分析发现，部分 Cathelicidin 基因在 P0 和 P10 幼崽肝脏中表达较高，在成年后表达降低，而在成年蜜袋鼯的骨髓中又高表达。这说明 Cathelicidins 的表达具有时空特异性。
3. Cathelicidins 的共表达由增强子共享驱动：部分 Cathelicidin 基因（如Camp3、Camp4、Camp6、Camp10和Ngp）在发育中的中性粒细胞中高度共表达。研究人员通过 ATAC-seq 在蜜袋鼯 P10 肝脏中鉴定出多个开放染色质区域，再结合 RCMC 技术，发现每个簇内至少有一个潜在的 CRE 与两个不同基因的启动子存在接触相互作用，这表明存在增强子共享现象。此外，两个簇之间也存在长距离（>1 Mb）的接触相互作用，说明基因可以跨簇共调节。通过基序富集分析和荧光素酶报告实验，研究人员还发现C/ebp转录因子是 Cathelicidin 表达的关键调节因子，但可能还需要其他转录因子来协调基因家族成员的调控。
4. 蜜袋鼯 Cathelicidins 的功能：为了探究蜜袋鼯 Cathelicidins 的功能，研究人员进行了一系列实验。首先，合成了 7 种蜜袋鼯 Cathelicidins 和Ngp的成熟肽，通过肉汤微量稀释抗菌试验发现，CAMP3、CAMP4、CAMP9 和 CAMP10 对多种细菌具有较强的抗菌活性，其中 CAMP4 的抗菌效果最为显著，其最低抑菌浓度（MIC）与人类和小鼠的 Cathelicidins 相当，甚至与常见抗生素相当。PI 吸收试验表明，具有抗菌活性的 Cathelicidins 能够直接杀死细菌，且对哺乳动物细胞的细胞毒性较低。此外，研究还发现 CAMP3 和 CAMP4 能够与脂多糖（LPS）结合，减少 LPS 与巨噬细胞的结合，降低肿瘤坏死因子 -α（TNF-α）的分泌，具有免疫调节功能。在体内小鼠败血症模型实验中，CAMP4 能够显著提高感染大肠杆菌小鼠的存活率，进一步证明了其在免疫保护中的重要作用。
5. 蜜袋鼯 Cathelicidins 的进化：研究人员对蜜袋鼯 Cathelicidins 的进化历史进行了研究。通过氨基酸序列比对发现，蜜袋鼯 Cathelicidins 在编码成熟效应肽的第四外显子区域经历了显著的序列多样化。在对 24 种哺乳动物和 4 种非哺乳动物四足动物的基因组分析中发现，有袋类和单孔类是仅有的拥有两个 Cathelicidin 基因簇的四足动物，真兽类哺乳动物和非哺乳动物四足动物各有一个基因簇。系统发育分析表明，Ngp基因仅存在于哺乳动物中，且是由早期哺乳动物或前哺乳动物合弓纲动物分化过程中的 Cathelicidin 基因演化而来。这表明哺乳动物 Cathelicidins 经历了多次进化事件，基因簇的复制、丢失以及Ngp基因的衍生，这些进化变化可能在塑造有袋类免疫防御中发挥了关键作用。

综合以上研究，研究人员得出结论：Cathelicidins 是有袋类新生儿早期免疫防御系统的关键组成部分。通过增强子共享和基因簇间的物理相互作用，部分 Cathelicidins 在中性粒细胞中高度共表达。这些 Cathelicidins 具有多种功能，包括抗菌和免疫调节，能够保护机体免受病原体侵害。有袋类和单孔类保留了两个 Cathelicidin 基因簇，这可能与它们新生儿高度未成熟、依赖先天免疫的特点有关。

该研究具有重要意义。它首次全面地揭示了有袋类新生儿免疫保护中 Cathelicidins 的作用机制，为理解有袋类动物的免疫防御提供了重要依据。同时，研究结果也挑战了传统观点，表明抗菌肽在哺乳动物免疫防御中可以作为主要参与者，而不仅仅是适应性免疫系统的次要辅助成分。此外，该研究还为进一步研究哺乳动物基因调控、生态学和进化提供了新的视角，有助于深入了解不同哺乳动物在免疫适应方面的差异，以及免疫相关基因家族的进化与生命历史特征之间的关系。然而，研究也存在一些局限性，如对蜜袋鼯自然环境中的病原体了解不足，对部分 Cathelicidin 基因的功能还未完全明确等，这也为后续研究指明了方向。