海马体如何重塑视觉表征以编码新记忆：揭示记忆形成的神经奥秘

本文聚焦于海马体 - 皮质相互作用在记忆编码中的作用。通过痕迹眨眼条件反射实验范式，发现小鼠视觉皮层（VIS）II 层神经元群体对配对刺激有独特反应，且该反应依赖海马体活动。研究揭示了记忆痕迹形成机制，为理解记忆编码提供重要依据。

　　### 研究背景
记忆在神经元网络中的编码和保留机制一直是神经科学领域的重要谜题。在哺乳动物大脑中，海马体（Hippocampus，HPC）对情境 / 陈述性记忆编码起着关键作用，同时在大脑皮质区域也发现了记忆痕迹或记忆印记细胞（engram cells）。海马体记忆索引理论认为，HPC 在记忆编码过程中通过突触可塑性机制创建分布式新皮质激活模式的索引，但该理论在记忆形成过程中 HPC - 新皮质通路的调控细节缺乏实验支持。眨眼条件反射是研究陈述性记忆过程的常用关联学习范式，其中痕迹眨眼条件反射涉及 HPC 和新皮质，可作为研究记忆编码和关联学习中 HPC - 新皮质相互作用的模型。

实验方法

1. 行为学实验：采用定制的隔音暗箱，对头部固定的小鼠进行训练。在蓝色 - 空气痕迹条件反射实验中，每天进行约 60 次试验，包括 80% 的关联试验（50ms 蓝光、250ms 延迟、20ms 吹气）和 20% 的提示（a.A.）试验（无吹气），持续 6 - 14 天。通过高速摄像头记录小鼠眼睑运动，计算眼睑闭合条件反应（Conditioned Response，CR）百分比和标准化眼球暴露百分比。
2. 病毒注射和纤维植入手术：对 10 - 12 周龄小鼠在立体定位仪引导下进行手术，向目标区域（如 VIS、DG 等）注射病毒（如 AAV9 - hsyn - GCaMP6f 等），并植入颅骨窗和钛头板，或植入光纤用于光遗传学实验。手术后小鼠恢复约 30 天再进行后续实验。
3. 体内双光子成像：对 3 - 5 个月大、接受病毒注射和颅骨窗植入的小鼠进行成像。使用 Olympus FVMPE - RS 直立显微镜，以特定激光激发，收集发射光，在小鼠清醒状态下记录钙信号。
4. 光遗传学操作：在光遗传学测试中，通过植入光纤向视觉皮层目标部位输送 473nm 激光，校准功率并避免激光干扰小鼠眼睛。记录激光开启后小鼠眼睑闭合情况，并与激光关闭时进行对比。
5. 药物注射：使用他莫昔芬（Tamoxifen，TM）标记特定时间窗口内的活跃神经元，使用氯氮平 - N - 氧化物（Clozapine - N - oxide，CNO）抑制 hM4Di 标记的神经元 / 中间神经元，玉米油和 PBS 分别作为 TM 和 CNO 的对照载体。
6. 数据处理与分析：使用自定义的半自动 MATLAB 代码进行数据处理，包括图像对齐、荧光信号提取和钙信号分析。通过主成分分析（Principal Component Analysis，PCA）展示神经元群体的主要活动模式，计算向量相似性得分和向量强度来衡量不同刺激间的相似性和活动模式强度。采用多种统计方法（如 Wilcoxon 符号秩检验、Mann - Whitney U 检验等）分析数据。

实验结果

1. 关联学习改变小鼠 VIS II 层对视觉线索的皮质表征：在 250ms 痕迹间隔训练中，短痕迹组小鼠在训练后产生明显的 CR，而长痕迹组和未训练对照组无此现象。双光子钙成像显示，在关联试验中，VIS II 层出现对配对刺激有反应但对单个刺激无反应的神经元群体。PCA 和向量相似性得分表明，该群体轨迹在 250ms 痕迹组中与单个刺激试验明显不同，且该群体形成迅速、具有时间灵活性、对刺激有特异性，即使在无吹气刺激时，其神经激活模式仍与关联场景相关。
2. 学习过程中海马体活动改变 VIS 中的视觉表征：通过 DREADD 技术抑制多个脑区，发现只有抑制海马体（尤其是齿状回，Dentate Gyrus，DG）会显著阻止 VIS 中视觉表征的改变。抑制 DG 会导致小鼠在痕迹条件反射早期无法形成关联记忆，且其视觉皮层神经反应与提示试验重叠。相反，激活 DG 能使小鼠在 15s 痕迹间隔训练中建立光与吹气的关联，同时改变 VIS 中的神经反应模式。
3. 关联激活群体的活动水平调节学习速度：根据小鼠在第 10 天的表现将其分为快速（>50% 眨眼）和慢速（<50%）学习者。快速学习者中关联激活群体的活动在早期训练中显著高于慢速学习者，且快速学习者的学习曲线在训练中期更陡峭。
4. 关联激活群体的活动水平有助于记忆的成功回忆：训练后第 10 天，分析小鼠在关联试验和 CS 单独回忆试验中的神经元活动与眨眼行为关系。发现关联激活神经元在 CS 单独命中试验中的活动明显高于未命中试验，尤其是在早期阶段，且部分在第一天关联试验中激活的神经元在第 10 天的命中试验中仍保持活跃，这些神经元的活动与记忆检索成功相关。
5. TRAP 标记的 VIS 中关联激活群体的 fos⁺细胞诱发记忆回忆：使用 TRAP 方法标记学习过程中激活的神经元，对 Fos - creER^T2小鼠注射病毒后进行训练和标记，随后光遗传学激活标记的 fos⁺神经元可诱发小鼠眨眼行为，表明关联激活的 fos⁺细胞是记忆痕迹。
6. TRAP 标记的 fos⁺细胞是关联训练中改变的视觉表征的枢纽神经元：通过实验发现，TRAP 标记的 fos⁺神经元在关联激活群体中占一定比例，且对特定关联刺激有更高的反应性和持续的钙活动。抑制 fos⁺神经元会影响关联激活群体的活动和皮质表征，表明其在维持早期关联训练中改变的视觉表征中起关键作用。
7. 局部回路中的 VIP⁺神经元有助于关联学习诱导的视觉表征改变：分析 VIS 中的局部抑制性中间神经元（PV⁺、SOM⁺和 VIP⁺神经元）对刺激的反应，发现 VIP⁺神经元在关联刺激下有特异性激活。抑制 VIP⁺神经元会改变关联激活群体的活动和群体活动轨迹，表明其在选择改变的皮质表征中起关键作用，且与关联记忆形成密切相关。

研究结论

1. 本研究通过体内钙成像观察到小鼠 VIS II 层在早期关联学习中，光诱发的神经元表征因光 - 吹气配对而改变，形成新的记忆痕迹。这些早期视觉表征变化依赖 DG 活动和局部抑制网络（尤其是 VIP⁺神经元）。
2. 研究强调了 HPC - 皮质在记忆编码过程中的关键相互作用，支持了 HPC 在记忆形成中的索引作用。记忆印记细胞作为皮质亚群，在配对事件后表现出早期关联激活和持续活动，编码与视觉线索相关的新关联记忆。
3. 海马体 - 皮质相互作用在记忆形成和检索中至关重要。本研究揭示了关联学习后 VIS 中立即发生的视觉表征变化，表明编码过程中早期皮质记忆痕迹的形成依赖 HPC（DG）活动，为海马体索引理论提供了实证支持。
4. 海马体 - 皮质相互作用依赖长程投射，经典的海马体输出通路和 EC 电路可能将 DG 活动传递到 VIS。VIP⁺中间神经元在选择改变的皮质表征中起关键作用，表明局部抑制网络在长程相互作用中对在 VIS 中生成记忆痕迹至关重要，为记忆编码和检索提供了灵活性和动态性。
5. 研究通过 TRAP 标记实时观察学习过程中的 VIS 活动，发现记忆印记细胞在早期学习中刺激停止后仍有持续活动，其较高和延长的神经元活动表明记忆痕迹的预调节和记忆分配。印记细胞活动对关联诱导的神经元表征的后期持续阶段至关重要，在记忆编码过程中作为 VIS 中持久关联记忆痕迹的中心枢纽。
6. 本研究还发现大脑中存在一个处于启动状态的子网，用于整合即将发生的事件以进行记忆编码和后续巩固过程，挑战了传统的记忆形成被动过程观点，强调了大脑网络子集为记忆编码的主动准备。

研究局限性

1. 眨眼痕迹条件反射在研究关联记忆时存在不足，CR - US 耦合会导致神经反应重叠，受感觉 - 运动干扰。
2. 基于 Fos 的记忆印记标记由于时间分辨率低，缺乏足够的特异性。
3. 由于钙荧光成像的动力学特性，无法为神经元群体提供更精确的尖峰时间信息。
4. 关联记忆痕迹形成过程中调节皮质 - 海马体串扰的生理联系仍不清楚，需要进一步研究。