非脊椎动物脊索动物中Anoctamin介导的多模态感知与幼虫变态的分子机制研究

本研究通过钙成像和定量行为分析，揭示了海鞘(Ciona intestinalis)幼虫变态过程中Ano5/Ano6(属TMEM16/ANO家族)介导化学-机械多模态感知的新机制。研究发现这两个进化保守的钙激活氯通道(CaCC)通过调节初级感觉神经元(PSNs)和轴柱细胞(ACCs)的钙响应动力学，协同IP3R、SERCA和CRAC等钙信号元件，在下游调控幼虫沉降和尾部退化。该成果为理解水生生物环境感知的分子工具包提供了重要线索。

　　

在海洋无脊椎脊索动物海鞘(Ciona intestinalis)的研究中，科学家们发现了一个调控幼虫多模态感知与变态过程的关键分子机制。这项研究聚焦于进化上高度保守的Anoctamin蛋白家族成员Ano5和Ano6，揭示了它们在海洋生物环境感知中的独特作用。

研究背景与科学问题
海洋环境是复杂感官刺激的熔炉，对浮游生物而言，同时感知化学和机械线索的能力至关重要。虽然瞬时受体电位(TRP)通道在海洋生物机械感受中的作用已被认识，但其他潜在的感觉传导分子仍待探索。Anoctamin家族蛋白作为钙激活氯通道(CaCC)和磷脂爬行酶(PS)，在神经元兴奋性调控中具有重要作用，但其在浮游生物多模态感知中的功能尚未阐明。

基因表达与亚细胞定位
通过转录融合分析发现，海鞘基因组编码的四个TMEM16/ANO成员中，Ano5(Tmem16E)和Ano6(Tmem16F)主要表达于幼虫中枢和周围神经系统，特别是在介导幼虫沉降的乳突器官的初级感觉神经元(PSNs)和轴柱细胞(ACCs)中。翻译融合实验进一步揭示：Ano5主要定位于内质网(ER)，少量分布于PSNs纤毛和ACCs指状突起；而Ano6除ER外，在感觉末梢结构中显著富集。

行为表型分析
利用CRISPR-Cas9技术构建的Ano5^CRISPR和Ano6^CRISPR单双突变体表现出显著的发育缺陷。在人工海水(ASW)或10mM NH₄Cl化学刺激下，突变体幼虫的沉降速率显著减慢。通过自动视频追踪系统(Ciona Tracker 2.0)结合DeepLabCut姿态分析发现，突变体尾部退化过程明显延迟，最终保留更长的尾部残余结构。定量分析显示，在ASW中20小时时，对照组幼虫完成变态的比例显著高于突变体(78% vs 32-45%)；NH₄Cl刺激下14小时的完成率差异更为明显(92% vs 51-63%)。

钙信号调控机制
使用GCaMP6s钙成像技术发现，Ano5和Ano6通过不同方式调节感觉细胞的钙动力学：在PSNs中，Ano5缺失导致机械刺激诱发的钙瞬变峰值振幅增加46%，而Ano6缺失使上升时间延长2.3倍；在ACCs中，Ano6缺失使机械响应频率从40%提升至68%。化学刺激实验表明，Ano6对NH₄Cl诱发的钙响应具有更强调控作用。全脑钙整合器CAMPARI2成像显示，突变体在化学刺激下全神经系统的钙活动传播显著减弱。

分子通路解析
通过化学遗传学工具hM3D(Gq)激活Gαq/11通路发现，直接激活PSNs和ACCs不能挽救突变体的表型，表明Ano5/Ano6位于初级传感器下游。药理学实验揭示它们与内质网钙释放通道IP₃R、钙泵SERCA和质膜钙通道CRAC协同工作：IP₃R抑制剂2-APB使变态率降至12%，与ANO抑制剂T16Ainh-A01联用产生叠加效应；CRAC抑制剂YM-58483与ANO抑制联用使变态完全抑制。

分子功能验证
异源表达实验首次证明海鞘Ano6具有离子霉素诱导的磷脂爬行酶活性，使膜表面磷脂酰丝氨酸(PtdSer)暴露增加3.2倍。在HEK293T细胞中，Ano5/Ano6与内皮素受体EDNRA共表达可显著增强内皮素-1诱导的钙信号：Ano6使钙峰面积增加215%，而Ano5主要延长信号持续时间。

进化与生物学意义
该研究揭示了Anoctamin家族在基础脊索动物感觉系统中的新功能，为理解从无脊椎动物到脊椎动物的感官系统进化提供了重要线索。海鞘幼虫乳突器官被认为是脊椎动物嗅基板的同源结构，而哺乳动物ANO2/ANO9也在嗅觉上皮中发挥类似功能，暗示这一调控机制在进化上的保守性。研究还提出了一个新颖的感官传导模型：环境刺激通过未知受体激活G蛋白/IP₃通路，随后Ano5/Ano6通过调节局部钙动态和膜电位，控制感觉神经元输出至中枢神经系统。

研究局限与展望
当前研究对Ano6的磷脂爬行酶活性仍需更多生化证据，如NDB-磷脂荧光法验证。未来研究应明确这两个蛋白的离子选择性和钙激活特性，并探索它们与其他感官分子(如TRP通道)的相互作用网络。这些发现不仅对理解海洋生物生态适应性具有重要意义，也为研究人类ANO相关感觉障碍疾病提供了新的比较模型。