HOXD1 基因：解开绵羊多角性状发育之谜的关键钥匙

为探究绵羊多角性状发育机制，研究人员以小鼠神经嵴细胞（NCCs）为对象，研究 HOXD1 基因功能。结果发现 HOXD1 诱导 NCCs 发生上皮 - 间质转化（EMT），影响细胞迁移，且可能通过调节 Wnt 信号抑制 NCCs 增殖，为多角绵羊育种提供理论依据。

　　在广袤的草原上，绵羊以其丰富多样的形态特征吸引着人们的目光，其中多角性状更是独特而神秘。多角绵羊不仅在维持生物多样性方面发挥着重要作用，还为观赏和科研提供了宝贵资源。然而，这一复杂的多角性状背后，其发育和生长的分子机制却如同隐藏在迷雾之中，一直未被完全揭示。以往的研究虽已将多角性状相关候选基因定位到多个染色体区域，但对于这些基因究竟如何调控多角性状的形成，仍知之甚少。为了揭开这层神秘的面纱，商丘师范学院、河南农业大学等研究机构的研究人员踏上了探索之旅，他们的研究成果发表在《Scientific Reports》上，为深入了解绵羊多角性状的发育机制带来了新的曙光。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，从 C57BL/6 小鼠胚胎中分离出神经嵴细胞（NCCs） ，这是研究的基础材料。接着运用过表达技术提高 NCCs 中 HOXD1 基因的表达水平，以探究该基因的功能。随后利用转录组测序技术，全面分析 HOXD1 基因过表达对绵羊多角性状发育的影响，筛选出相关的关键信号通路。

研究结果如下：

1. NCCs 的分离与鉴定：研究人员从 C57BL/6 孕鼠胚胎的第一鳃弓组织块成功分离出 NCCs。培养 12 小时后，组织块周围出现纺锤形细胞迁移，48 小时后细胞贴壁生长，形态符合神经细胞特征。通过 SOX10 基因免疫荧光染色，发现 95% 以上的细胞 SOX10 表达呈阳性，证实所分离细胞为 NCCs，为后续研究奠定了坚实基础。
2. 载体构建与细胞转染：成功构建重组 pcDNA3.1 - HOXD1 载体，经测序验证后，将其转染到小鼠神经嵴细胞中。定量分析显示，处理组中 HOXD1 基因的表达水平显著高于对照组（P<0.001），表明转染成功，为进一步研究 HOXD1 基因的功能提供了有效工具。
3. 划痕实验：通过细胞划痕实验评估细胞迁移能力。结果显示，HOXD1 基因过表达组在 6 小时和 24 小时时的迁移效率显著提高（P<0.05） ，表明 HOXD1 基因过表达可显著抑制神经嵴细胞的迁移能力，揭示了 HOXD1 基因对细胞迁移的重要调控作用。
4. CCK - 8 和细胞周期流式检测：CCK - 8 实验表明，HOXD1 基因过表达与对照组相比，对 NCCs 的增殖没有显著影响（P>0.05） 。细胞周期分析显示，HOXD1 基因过表达处理 48 小时后，细胞在 G₁、G₂和 S 期的比例与对照组相比无显著差异（P>0.05） ，细胞在 G₁/G₂期的比例也无明显变化（P>0.05） ，说明 HOXD1 基因过表达不影响小鼠 NCCs 的细胞周期。
5. 对 EMT 标记基因 mRNA 水平和蛋白质表达的影响：qRT - PCR 检测 EMT 标记基因表达水平，WB 验证相关蛋白质表达。结果显示，HOXD1 基因在 NCCs 中的表达显著高于对照组（P<0.01） ，且过表达 HOXD1 基因显著增加了间质标记基因波形蛋白（Vimentin）和 E - 钙粘蛋白（E - cadherin）的表达（P<0.05） ，而 α - 平滑肌肌动蛋白（α - SMA）的表达无显著增加（P>0.05） 。蛋白质分析表明，E - cadherin 蛋白水平显著升高（P<0.01） ，但 Vimentin 和 α - SMA 蛋白水平无明显变化（P>0.05） 。这些结果表明，HOXD1 基因过表达可能通过调节 Vimentin 和 E - cadherin 的表达诱导 NCCs 发生 EMT。
6. Wnt 和 TGF 信号通路关键基因的表达：检测 Wnt 和 TGF 信号通路关键基因的表达水平，发现 HOXD1 基因过表达显著增加了 Wnt 通路中 Wnt2 和 β - 连环蛋白（β - catenin）的 mRNA 表达（P<0.05） ，但对 TGF 通路中 TGF-β、TGF - BR、Smad3 和 Smad4 的 mRNA 水平无显著影响（P>0.05） 。WB 分析进一步证实，HOXD1 基因过表达增加了 NCCs 中 Wnt2、β - catenin 和 TGF - BR 的蛋白水平，同时显著降低了 Smad4 的蛋白水平。这些结果表明，HOXD1 基因主要调节 Wnt 信号通路，而非 TGF - β 信号通路，且可能通过调节 Wnt 信号抑制 NCCs 增殖。
7. NCCs 中 HOXD1 共表达基因的分析：对 HOXD1 基因过表达的 NCCs 进行转录组测序分析，共鉴定出 139 个差异表达基因（DEGs） ，其中 59 个基因表达下调，80 个基因表达上调。KEGG 富集分析显示，差异表达基因显著富集于细胞因子 - 受体相互作用通路，其中 12 个下调基因主要属于趋化因子 CXC 家族。GO 富集分析表明，这些差异表达基因主要与 CXCR 趋化因子受体结合、生长因子活性和细胞因子活性相关。此外，对 KEGG 信号通路外的差异表达基因进行注释发现，大多数差异表达基因位于细胞外基质，且与骨分化和细胞迁移相关。这表明趋化因子 CXC 家族可能是 HOXD1 基因的下游调节因子，通过改变细胞外因子影响细胞迁移。

研究结论和讨论部分指出，研究人员成功分离出小鼠 NCCs，并发现 HOXD1 基因可将小鼠神经嵴原代细胞转化为 EMT 过渡细胞，影响细胞迁移能力但不显著影响增殖。信号通路分析表明，HOXD1 基因可能通过调节 Wnt 信号通路而非 TGF - β 信号通路抑制 NCCs 增殖。转录组分析显示，HOXD1 基因影响趋化因子 CXC 家族调节细胞的细胞外基质，并促进神经嵴细胞分化。这些发现为绵羊多角性状的分子标记育种提供了技术基础，为深入研究多角绵羊生长调控机制奠定了理论基础，同时也为研究 HOXD1 基因在哺乳动物胚胎生长发育中的功能提供了实验参考，在生命科学和畜牧养殖领域具有重要的意义。