揭开托斯卡纳病毒神秘面纱：糖蛋白遗传多样性对病毒特性的重大影响

为探究托斯卡纳病毒（TOSV）遗传多样性对其生物学特性的影响，研究人员以 TOSV 的 A、B 两个谱系菌株为对象开展研究。结果表明，Gn 和 Gc 糖蛋白序列影响病毒复制适应性、进入动力学和新产生病毒粒子的感染性。这为深入了解 TOSV 提供了关键依据。

　　在病毒的微观世界里，托斯卡纳病毒（Toscana virus，TOSV）是一种不容忽视的存在。它隶属于布尼亚病毒目（Bunyavirales）、 Phenuiviridae 科，是一种通过白蛉传播的虫媒病毒。自 1971 年在意大利首次被分离出来后，如今已在地中海盆地的 23 个国家现身。TOSV 感染人类后，多数情况下无症状或仅引发轻微症状，但一旦病毒侵入中枢神经系统（central nervous system，CNS） ，就可能进展为严重的神经系统疾病，成为夏季人类脑膜炎和脑炎的主要致病因素之一。

目前，根据系统发育分析，已鉴定出两个主要的 TOSV 遗传谱系 A 和 B，近期还发现了谱系 C，但尚未分离出该病毒。尽管 TOSV 对人类健康影响显著，可它仍是一种研究不足的病原体，其遗传多样性对病毒致病性的影响也尚不明确。这一知识空白阻碍了对 TOSV 疾病的深入理解和预防措施的制定。

为了填补这些空白，来自法国 INRAE、Universite Claude Bernard Lyon 1 等机构的研究人员展开了一项重要研究。他们运用反向遗传方法，对属于谱系 A 和 B 的两个 TOSV 菌株（TOSV-A 和 TOSV-B）进行研究，相关成果发表在《npj Viruses》上。

研究人员在此次研究中主要运用了以下几种关键技术方法：首先是反向遗传技术，通过构建 TOSV-B 的反向遗传系统，对病毒基因组进行操作；其次是病毒滴度检测技术，如 TCID₅₀ 检测和焦点形成试验（FFU） ，用于测定病毒的感染性；此外，还运用了蛋白质分析技术，像 western blot 来研究蛋白质的表达和特性；基因定量技术，借助 RT-qPCR 对病毒基因组进行定量；以及透射电镜技术，用于观察病毒粒子的结构。

下面来看具体的研究结果：

1. TOSV-B 反向遗传系统的开发：研究人员成功开发了 TOSV-B 的反向遗传系统。在构建过程中，对野生型 TOSV-B 的三个反基因组片段（Seg-S、Seg-M 和 Seg-L）进行 RT-PCR 扩增并克隆到反向遗传质粒中。经测序比对，发现多个核苷酸替换，通过重新测序和定点诱变确保了质粒序列的准确性。
2. rTOSV-A 复制能力强于 rTOSV-B：比较 TOSV-A 和 TOSV-B 拯救病毒（rTOSV-A 和 rTOSV-B）与亲本病毒的复制率，结果显示 rTOSV-A 在 A549 和 A549 Npro 细胞中的病毒滴度高于野生型 TOSV-A，且 rTOSV-B 和野生型 TOSV-B 的病毒滴度低于 rTOSV-A 和野生型 TOSV-A，表明 TOSV-A 和 TOSV-B 的复制差异不依赖于 I 型干扰素（IFN-I）途径。
3. Seg-M 调节 TOSV 体外复制：通过构建重组病毒库评估 TOSV 三个基因组片段对病毒滴度差异的影响，发现携带 TOSV-A 的 Seg-S 和 Seg-L 以及 TOSV-B 的 Seg-M 的 rTOSV-A-MB 病毒滴度显著低于 rTOSV-A，反之，rTOSV-B-MA 病毒滴度显著高于 rTOSV-B，证明 Seg-M 是 rTOSV-A 复制率更高的关键决定因素。
4. Gn-Gc 编码序列调节 TOSV 复制：由于 TOSV Seg-M 编码的多蛋白经宿主蛋白酶切割成 NSm、Gn 和 Gc，研究人员构建嵌合 Seg-M 病毒来探究哪个蛋白参与调节 TOSV 复制率。结果显示，交换 NSm 编码序列的两种嵌合病毒复制动力学无显著差异，而 rTOSV-AGnGcB 病毒滴度显著低于 rTOSV-A，rTOSV-B-GnGcA 病毒滴度显著高于 rTOSV-B，表明 Gn-Gc 编码序列是 rTOSV-A 复制率更高的原因。
5. rTOSV-A 病毒粒子内化更快：研究病毒进入过程发现，rTOSV-A 在温度转变后 10 分钟内开始进入细胞，达到半最大水平（t_1/2 ）的时间为 22.84 ± 1.19 分钟，而 rTOSV-B 达到 t_1/2 的时间为 34.88 ± 1.34 分钟，说明 rTOSV-A 进入细胞的速度比 rTOSV-B 快。
6. rTOSV-B 的 Gn-Gc 更丰富：western blot 分析显示，rTOSV-B 的 Gc 分子量比 rTOSV-A 约低 0.9kDa ，但二者糖基化模式无差异。rTOSV-B 感染细胞的 Gc 水平显著高于 rTOSV-A，且其细胞培养上清液中 Gn 和 Gc 水平也更高，表明更多的 Gn 和 Gc 被整合到新产生的 rTOSV-B 病毒粒子中。
7. 新产生的 rTOSV-A 病毒粒子感染性更高：尽管 rTOSV-B 感染细胞释放的 Seg-S 和 Seg-M 多于 rTOSV-A，但 rTOSV-A 产生的感染性病毒粒子更多。计算基因组拷贝数与感染性病毒粒子数的比值发现，rTOSV-B 的该比值显著高于 rTOSV-A，说明 rTOSV-A 产生感染性病毒粒子的效率更高。
8. 病毒粒子大小和结构存在差异：透射电镜观察发现，rTOSV-A 和 rTOSV-B 病毒粒子在细胞培养上清液中的表面结构不同，rTOSV-B 的表面更有序。且细胞外病毒粒子大小存在显著差异，rTOSV-B 比 rTOSV-A 大 20nm。

综合研究结论和讨论部分，此次研究意义重大。研究人员通过开发新的反向遗传系统，对 TOSV-A 和 TOSV-B 进行比较研究，揭示了 TOSV 遗传多样性对其生物学特性的显著影响。Gn 和 Gc 糖蛋白编码序列不仅决定了病毒的复制动力学，还影响病毒进入细胞的速度、新产生病毒粒子的感染性以及病毒粒子的结构和大小。这些发现为深入理解 TOSV 的致病机制提供了关键线索，有助于更精准地监测 TOSV 的传播和变异。同时，也为开发针对 TOSV 的防控策略，如疫苗研发等，提供了重要的理论依据，为保障人类健康奠定了基础。