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为探究热应激（HS）对山羊睾丸支持细胞（SCs）的损伤机制及褪黑素的保护作用，西北农林科技大学研究人员建立体内外 HS 模型开展研究。结果表明 HS 通过 ROS-DRP1 通路诱导线粒体裂变、抑制自噬通量，导致 SCs 凋亡，褪黑素可缓解该过程。该研究为抗 HS 药物研发提供新思路。
在全球气候变暖的大背景下，高温天气愈发频繁，这给畜牧业带来了不小的挑战。对于山羊养殖来说，热应激（HS）成为了影响其繁殖能力的一大难题。雄性山羊在热应激状态下，生殖系统会受到不同程度的损害，这其中，支持细胞（SCs）的变化备受关注。支持细胞为生殖细胞提供结构和营养支持，对维持睾丸的正常功能至关重要。但目前，热应激究竟如何影响山羊支持细胞，其背后的分子机制并不明确，而且褪黑素作为一种经典的抗氧化剂，虽能减轻热应激对雄性生殖系统的损伤，可它对山羊睾丸支持细胞的保护机制也有待进一步研究。在这样的情况下，西北农林科技大学的研究人员开展了一系列研究，试图揭开这些谜题。
研究人员建立了雄性山羊体内热应激模型，并在体外对原代山羊支持细胞进行热应激处理。通过一系列实验，他们发现热应激会导致山羊精液质量下降，睾丸组织受损，支持细胞数量减少且发生凋亡。从机制方面来看，热应激使得支持细胞内活性氧（ROS）生成增加，线粒体膜电位降低，ATP 合成减少。同时，热应激还改变了线粒体裂变和融合相关蛋白的表达，促进了线粒体裂变相关蛋白 FIS1 和 DRP1 的表达，抑制了线粒体融合蛋白 MFN1、MFN2 和 OPA1 的表达，最终导致线粒体过度裂变，引发线粒体依赖的细胞凋亡。此外，热应激虽然激活了上游的线粒体自噬，但却抑制了自噬通量，使得受损线粒体无法正常被清除，进一步加剧了细胞凋亡。而褪黑素则可以通过降低 ROS 水平，恢复线粒体的动态平衡和自噬通量，从而减轻热应激诱导的支持细胞凋亡。
这项研究成果发表在《Journal of Animal Science and Biotechnology》上，它揭示了热应激诱导山羊支持细胞凋亡的新机制，为理解热应激对雄性生殖系统的影响提供了重要依据，也为开发针对热应激的药物提供了新的方向，有助于提高山羊在热应激环境下的繁殖能力，对畜牧业的可持续发展具有重要意义。
研究人员开展研究用到的主要关键技术方法包括：建立体内外热应激模型，体内选取健康雄性关中奶山羊，分为对照组和热应激组，热应激组山羊在夏季高温时段于户外暴露 7 周；体外对原代山羊支持细胞进行 42°C 热应激处理 30min。采用细胞计数试剂盒 8（CCK-8）检测细胞活力，通过流式细胞术检测细胞凋亡、线粒体膜电位（MMP），利用透射电子显微镜观察细胞超微结构，运用免疫荧光和蛋白质免疫印迹（Western blotting）技术检测相关蛋白表达水平 。
研究结果如下：
- HS 导致山羊精液质量下降：与对照组相比，热应激组山羊精子数量、密度、精子质膜和顶体完整性均显著降低，表明热应激影响山羊繁殖能力。
- HS 诱导睾丸损伤和 SCs 数量减少：通过苏木精 - 伊红（HE）染色发现热应激破坏睾丸生精小管结构，免疫荧光染色显示热应激使睾丸中 SCs 数量显著减少，TUNEL 检测结合免疫组化表明热应激诱导 SCs 凋亡，透射电镜证实热应激破坏相邻 SCs 间紧密连接。
- HS 诱导原代山羊 SCs 凋亡和 ROS 产生：热应激处理后，SCs 活力显著下降，ROS 和线粒体 ROS 水平升高，细胞凋亡增加，说明热应激与山羊 SCs 凋亡有关。
- HS 诱导山羊 SCs 线粒体过度裂变：用 mitotracker red 染色发现热应激组线粒体呈点状，形态破碎，透射电镜观察到线粒体肿胀、嵴结构破坏等。蛋白质免疫印迹检测显示热应激组 DRP1、P-DRP1 和 FIS1 表达升高，MFN1、MFN2 和 OPA1 表达降低，表明热应激促进 DRP1 向线粒体转位，导致线粒体过度裂变。
- HS 诱导山羊 SCs 线粒体功能障碍和线粒体依赖性凋亡：热应激使线粒体 Ca2+水平和 MCU 表达升高，线粒体膜电位降低，ATP 含量减少，同时促凋亡蛋白 BAX、Cleaved-caspase3 和 Cytc 水平升高，提示热应激可能通过激活 Cytc-caspase 级联反应诱导凋亡。
- 抑制线粒体裂变可阻断线粒体依赖性凋亡：使用 DRP1 抑制剂 Mdivi-1 处理后，热应激诱导的线粒体碎片化、ROS 增加、ATP 和 MMP 降低得到缓解，相关蛋白表达改变，细胞凋亡减少，表明 Mdivi-1 可抑制 DRP1 介导的线粒体裂变，挽救热应激诱导的线粒体依赖性凋亡。
- HS 诱导的 SCs 线粒体功能障碍与线粒体自噬有关：透射电镜和免疫荧光结果显示热应激增加自噬小泡数量，上调自噬相关蛋白表达，但同时减少线粒体与溶酶体的共定位，表明热应激启动线粒体自噬但抑制自噬通量，导致 SCs 凋亡。
- 褪黑素通过恢复线粒体稳态挽救 HS 诱导的 SCs 线粒体依赖性凋亡：实验筛选出 0.5μmol/L 褪黑素用于后续实验，结果显示褪黑素可降低热应激诱导的线粒体 ROS 水平，调节线粒体裂变和融合相关蛋白表达，抑制线粒体自噬，恢复自噬通量，减少线粒体依赖性凋亡相关蛋白表达，降低细胞凋亡率。
研究结论表明，热应激暴露诱导山羊支持细胞线粒体过度裂变和功能障碍，引发线粒体依赖性凋亡，同时热应激抑制自噬通量进一步加剧凋亡。而褪黑素可通过清除 ROS，维持线粒体稳态，抑制过度线粒体裂变和恢复自噬通量，减少线粒体依赖性凋亡。这一研究成果不仅加深了人们对热应激诱导细胞凋亡机制的理解，还为在畜牧生产中应对热应激对山羊繁殖的影响提供了理论基础和潜在的干预策略，有望为提高山羊养殖效益、保障畜牧业可持续发展发挥重要作用。
