L-741626 靶向 Ref-1 抑制 MAPK/ERK 通路：肝细胞癌治疗新希望

肝细胞癌（HCC）治疗面临困境，现有疗法效果有限。研究人员开展了关于 L-741626 对 HCC 作用的研究。结果发现 L-741626 能抑制 HCC 进展，还可与索拉非尼协同增效。该研究为 HCC 治疗提供了新方向。

　　肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma，HCC）是全球范围内常见且极具挑战性的恶性肿瘤，严重威胁人类健康。它是消化系统的 “恶魔”，在癌症相关死亡原因中位居第四。早期 HCC 若能及时发现，通过消融和手术切除有可能治愈，但大多数患者确诊时已处于晚期，5 年生存率低于 15%。而且，晚期 HCC 对化疗耐药，传统的索拉非尼（Sorafenib）治疗效果也不尽人意，客观缓解率仅 2.2%，总生存期延长不足 3 个月，患者极易产生耐药性，寻找新的治疗方案迫在眉睫。

在此背景下，郑州大学的研究人员开展了关于 L-741626 对肝细胞癌作用的研究。他们发现 L-741626 这种小分子化合物在抑制 HCC 进展方面展现出巨大潜力，相关成果发表于《Biology Direct》。

研究人员采用了多种关键技术方法。在细胞实验中，利用 CCK8 实验检测细胞活力，通过 Transwell 实验分析细胞迁移能力，运用流式细胞术检测细胞凋亡水平。为确定 L-741626 的作用靶点，进行了分子对接和药物亲和反应靶点稳定性测定（DARTS）实验。还构建了动物模型，开展体内动物实验，验证药物疗效。此外，通过免疫组化、免疫共沉淀（Co-IP）等实验探究分子间的相互作用。

研究结果如下：

1. L-741626 抑制 HCC 细胞生长：研究人员对 Huh7、HepG2 和 Hep3B 三种 HCC 细胞系进行体外实验。CCK8 实验表明，L-741626 抑制 HCC 细胞增殖，且抑制效果随浓度和处理时间增加而增强。集落形成实验和 Ki-67 免疫荧光实验进一步证实其对细胞增殖的抑制作用。Transwell 实验显示，L-741626 可抑制细胞迁移能力。Annexin V/7AAD 染色检测发现，该化合物能显著提高细胞凋亡率。
2. L-741626 通过抑制 MAPK/ERK 信号通路发挥抗肿瘤作用：对处理前后的 Huh7 和 HepG2 细胞进行 RNA 测序，KEGG 通路富集分析发现，L-741626 处理后，MAPK 信号通路受到抑制。Western blotting 检测显示，L-741626 降低了 p-ERK1/2 的表达水平，免疫荧光实验也证实了这一点。qPCR 检测发现，MAPK/ERK 通路相关分子 C-MYC、EGFR 和 SRF 的 mRNA 水平显著下降。使用 ERK 通路激活剂 TBHQ 进行的拯救实验表明，TBHQ 可削弱 L-741626 的抗肿瘤作用，说明 L-741626 通过抑制 MAPK/ERK 信号通路发挥抗肿瘤效果。
3. L-741626 通过靶向 Ref-1 发挥抗肿瘤作用：L-741626 虽为多巴胺 D2 受体拮抗剂，但 HCC 组织中这些受体表达极少，说明其作用机制并非通过该受体。利用 SuperPred 数据库预测靶点，分子对接实验发现 L-741626 可与 Ref-1 的 N 端多个氨基酸位点结合。DARTS 实验证实 Ref-1 是 L-741626 的直接靶点。TCGA 数据库数据和临床样本免疫组化分析显示，Ref-1 在 HCC 中高表达，且与肿瘤分期和患者生存率相关。构建 Ref-1 敲低的 Huh7 和 HepG2 细胞系，CCK8 实验表明 Ref-1 敲低抑制细胞增殖，说明 L-741626 通过抑制 Ref-1 发挥抗肿瘤活性。
4. Ref-1 通过维持 CRAF 功能正向调节 MAPK/ERK 通路：研究人员对 Ref-1 敲低和未敲低的细胞系进行实验，发现 Ref-1 敲低降低了细胞对 L-741626 的敏感性，且抑制了 MAPK/ERK 信号通路的活性。通过 GEPIA 2 数据库分析和 Co-IP 实验，证实 Ref-1 与 CRAF 在 HCC 中存在正相关且能直接相互作用。由此得出，L-741626 靶向 Ref-1，破坏 Ref-1 与 CRAF 的相互作用，进而抑制 MAPK/ERK 信号通路活性。
5. L-741626 协同增强索拉非尼的抗肿瘤效果：索拉非尼是治疗 HCC 的经典药物，但肿瘤干细胞的存在导致其耐药性问题。体外成球实验表明，L-741626 可抑制 Huh7 和 HepG2 细胞的肿瘤干性，Western blotting 检测发现其降低了肿瘤干性标记物 CD133 的表达。体内外实验均显示，索拉非尼与 L-741626 联合使用，抗肿瘤效果显著优于单药治疗，且未发现明显毒副作用。

研究结论和讨论部分指出，L-741626 是一种具有潜力的治疗 HCC 的小分子化合物，它通过靶向 Ref-1，阻断 Ref-1 与 CRAF 的结合，抑制 MAPK/ERK 信号通路，从而抑制 HCC 细胞增殖。同时，L-741626 还能抑制肿瘤干性，与索拉非尼联合使用可协同增强抗肿瘤效果。不过，该研究也存在一些局限性，如缺乏临床数据支持，L-741626 与 Ref-1 以及 Ref-1 与 CRAF 的结合位点和相互作用机制有待进一步研究，纳米颗粒递送 L-741626 的方式也值得探索。尽管如此，这项研究为 HCC 的靶向治疗提供了新的思路和潜在策略，有望为 HCC 患者带来新的希望。