光遗传学诱导TDP-43聚集损害线虫神经元功能与行为的机制研究

研究者通过光遗传学技术构建可时空调控的TDP-43蛋白聚集模型，首次在秀丽隐杆线虫中证实TDP-43聚集体的形成直接导致GABA能运动神经元退行性病变及感觉运动功能障碍，文章发表在《Translational Neurodegeneration，》为ALS/FTLD等TDP-43蛋白病的治疗靶点筛选提供了创新平台。

　　

在神经退行性疾病研究领域，TAR DNA结合蛋白43(TDP-43)的异常聚集被认为是肌萎缩侧索硬化症(ALS)和额颞叶变性(FTLD)等疾病的关键病理特征。然而长期以来，科学界对TDP-43聚集究竟是神经退行性变的起因还是后果存在争议。这种认知鸿沟主要源于缺乏能够精确控制TDP-43聚集时空动态的实验模型。传统方法往往依赖极端应激条件诱导蛋白聚集，难以模拟疾病自然进程。韩国首尔大学Kyung Won Kim团队创新性地将光遗传学技术与模式生物秀丽隐杆线虫相结合，为这一难题提供了突破性解决方案。

研究采用光诱导蛋白聚集(optoDroplet)技术，通过将人类TDP-43与拟南芥光敏蛋白Cryptochrome 2(Cry2)的寡聚化结构域(Cry2olig)融合，构建了可光控的opto-hTDP-43[mCherry::hTDP-43::Cry2olig]蛋白。利用线虫透明的生物学特性，实现了在活体神经元中时空精确诱导TDP-43聚集。关键技术包括：1)构建含rgef-1启动子的神经元特异性表达系统；2)通过蓝光照射诱导蛋白相分离；3)荧光恢复后漂白(FRAP)分析蛋白聚集态动力学；4)联合GABA能神经元报告株CZ13799进行形态学观察；5)通过液体抖动(thrashing)和固体运动实验评估行为缺陷。

光遗传学诱导TDP-43聚集在神经元中的定位与动态特征
在黑暗条件下，opto-hTDP-43主要定位于神经元核内，与天然TDP-43分布一致。蓝光照射72小时后，该蛋白在细胞核、胞质和神经突中形成明显凝聚体。FRAP分析显示这些凝聚体荧光恢复率显著低于单纯Cry2olig形成的液滴，表明TDP-43通过其内在无序区(IDR)促进了不可逆聚集体的形成。值得注意的是，停止光照后Cry2olig凝聚体在6小时内解离，而opto-hTDP-43聚集体保持稳定达12小时以上，这种特性与ALS患者脑中病理性TDP-43包涵体的不可溶性高度相似。

TDP-43聚集对特定神经元亚型的选择性毒性
研究观察到opto-hTDP-43聚集导致GABA能运动神经元出现显著退行性改变：腹侧神经索出现断裂，形成细小的分支样结构。定量分析显示，光照使严重缺陷(≥2处断裂)的神经元比例从25%增至60%。这种毒性具有细胞类型特异性，胆碱能和多巴胺能神经元在相同条件下未表现明显损伤。这种选择性可能与不同神经元亚型对蛋白稳态压力的敏感性差异有关。

运动与感觉行为的功能障碍
行为学分析揭示了TDP-43聚集的多系统影响。液体抖动实验中，光照组opto-hTDP-43线虫运动频率下降40%；固体培养基运动轨迹分析显示其活动范围缩减65%。在食物趋化实验中，野生型线虫60分钟内全部到达细菌 lawn，而opto-hTDP-43组仅30%完成迁移。机械刺激实验进一步证实感觉功能受损，这与人类ALS患者的感觉运动整合障碍临床表现相呼应。

寿命缩短与病理相关性
持续光照使opto-hTDP-43线虫中位寿命缩短20%，而对照组线虫不受光照影响。这种寿命缩短与神经元退行性变的严重程度呈正相关，证实TDP-43聚集具有系统性毒性。

该研究通过建立首个光遗传学调控的线虫TDP-43蛋白病模型，揭示了几个重要机制：1)TDP-43通过IDR介导的液液相分离(LLPS)向不可逆聚集态转化；2)聚集体的形成直接导致特定神经元亚型的退行性变；3)这种细胞自主性损伤引发多系统功能障碍。这些发现为ALS/FTLD的"获得性毒性"假说提供了直接证据，突破了传统模型无法区分因果关系的局限。技术层面，该研究开创了在活体动物中时空精确操控蛋白聚集的新范式，其optoDroplet技术平台可用于其他蛋白聚集相关疾病的研究。临床转化方面，该线虫模型的高通量特性为靶向TDP-43相分离过程的药物筛选提供了理想工具。未来研究可进一步探索不同神经元亚型对TDP-43毒性的抵抗机制，以及IDR关键残基的修饰对聚集过程的调控作用。