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为解决角膜缘微环境稳态维持机制不明的问题，研究人员开展了对角膜缘上皮祖细胞（LEPC）、角膜缘间充质基质细胞（LMSC）和角膜缘黑素细胞（LM）来源的小细胞外囊泡（sEV）的研究。结果发现 LEPC 来源的 sEV 有独特分子特征，可能是角膜缘微环境重要信号介质，对理解角膜缘微环境稳态意义重大。
角膜，作为眼睛的重要组成部分，其透明且无血管的特性至关重要，就像一扇清澈的窗户，让光线顺利透入，保障我们清晰视物。而角膜上皮作为角膜的最外层，肩负着维持角膜透明度和视觉敏锐度的重任，这依赖于角膜上皮细胞的不断更新和修复，其背后的 “功臣” 便是角膜缘上皮祖细胞（Limbal epithelial progenitor cells，LEPC） 。LEPC 存在于角膜缘的基底上皮层，在一个由多种细胞和细胞外基质（Extracellular matrix，ECM）构成的特殊微环境（niche）中发挥作用，角膜缘间充质基质细胞（Limbal mesenchymal stromal cells，LMSC）和角膜缘黑素细胞（Limbal melanocytes，LM）等都是这个微环境的重要成员，它们与 LEPC 相互协作，共同维持着角膜上皮的稳态。
在细胞间的 “交流” 过程中，细胞外囊泡（Extracellular vesicles，EV）逐渐崭露头角，成为关键的 “信使”。这些 EV 就像一个个装满 “货物” 的小包裹，里面搭载着蛋白质、脂质和核酸等重要物质，通过旁分泌和自分泌的方式，将这些 “货物” 传递给受体细胞，进而影响细胞的功能和命运。小细胞外囊泡（Small extracellular vesicles，sEV）作为 EV 的一种，尺寸在 40 - 150nm 之间，在细胞间通讯中扮演着极为重要的角色，在疾病诊断和治疗等方面也展现出巨大的潜力。然而，在角膜生物学领域，对 EV 的研究才刚刚起步，尤其是 LEPC 来源的 sEV，其全面特征尚未明确，不同角膜缘细胞类型来源的 sEV 蛋白质组比较数据也十分匮乏。为了填补这些知识空白，来自德国弗莱堡大学医学中心眼科中心等机构的研究人员开展了深入研究，相关成果发表在《Stem Cell Reviews and Reports》杂志上。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先，从人类供体的角膜缘组织中分离出 LEPC、LMSC 和 LM，这些组织来源于进行 Descemet 膜内皮角膜移植（DMEK）后剩余的组织，并获得了相应的研究许可和捐赠者知情同意。接着，采用切向流过滤（Tangential flow filtration，TFF）和尺寸排阻色谱（Size exclusion chromatography，SEC）技术从这些细胞的条件培养基中分离 sEV。随后，利用纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle tracking analysis，NTA）、蛋白质浓度测定、透射电子显微镜（Transmission electron microscopy，TEM）、Western blot 分析和蛋白质组学等多种方法对分离得到的 sEV 进行全面表征。
研究结果如下：
- sEV 的富集与表征：通过 FACS 技术成功分离出 LEPC、LMSC 和 LM 细胞。在制备 sEV 的过程中，发现 LEPC 在更换培养基后形态发生明显变化，收获条件培养基时细胞活力良好。NTA 分析显示，F3 组分中 sEV 颗粒浓度最高，且 LEPC 产生的 sEV 数量明显低于 LMSC 和 LM。此外，LEPC - sEV 的平均峰值大小为 150.5±19.3nm ，与其他细胞类型来源的 sEV 大小相似。Western blot 分析表明，EV 标记蛋白 Alix、CD9、CD63 和 CD81 在 F3 组分中富集，同时检测到 LEPC 特异性标记蛋白 CK17/19 等，且未检测到内质网标记蛋白 calnexin（CANX）和牛血清白蛋白（BSA），证明了 sEV 的有效分离和高纯度。TEM 和 Cryo TEM 分析进一步证实了 F3 组分中 sEV 的典型形态和脂质双层结构，且其大小在 50 - 200nm 之间，存在一定的异质性。
- 蛋白质组学分析：蛋白质组学研究共鉴定出 1307 种独特蛋白质，其中 450 种在至少 3 个生物学重复中稳定检测到。这些蛋白质涉及多种功能，包括细胞膜和内体相关蛋白、细胞骨架蛋白、热休克蛋白等，还包含一些已知的谱系特异性抗原，如角蛋白（KRT14、KRT17）等。通过对 sEV 纯度的评估，发现 LEPC - sEV 中不存在常见的污染物，如载脂蛋白、细胞核和线粒体相关蛋白等，再次证明了其高纯度。
- 功能富集分析：基因本体（Gene Ontology，GO）和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析表明，LEPC - sEV 富含与伤口愈合、角质形成细胞分化、表皮发育、肽酶活性调节和细胞外基质组织等相关的蛋白质。这表明 LEPC - sEV 在维持组织完整性和功能方面发挥着重要作用，可能参与细胞 - 基质相互作用、细胞粘附信号传导和细胞骨架动力学等过程。
- 比较蛋白质组分析：将 LEPC - sEV 的蛋白质组数据与之前报道的 LMSC - sEV 和 LM - sEV 数据进行比较，发现 13.0% 的蛋白质在所有细胞类型来源的 sEV 中都存在，36% 的蛋白质仅在 LEPC - sEV 中出现。这些独特的蛋白质与表皮发育、角质形成细胞分化、中间丝组织和肽酶活性调节等功能相关。此外，KEGG 通路分析还揭示了 LEPC - sEV 与蛋白酶体、细胞骨架和神经退行性疾病通路的联系。
研究结论和讨论部分指出，该研究成功从角膜缘干细胞微环境中的关键细胞类型 LEPC 中分离出 sEV，并通过蛋白质组学分析揭示了这些 sEV 可能在表皮细胞分化 / 发育、ECM 调节和角膜缘微环境内细胞间通讯中发挥信号作用。然而，研究也存在一定的局限性，例如体外培养细胞可能无法完全反映体内角膜缘微环境，使用器官培养角膜进行细胞分离可能影响细胞特性和 sEV 特征，且缺乏功能实验直接证明 LEPC - sEV 在调节角膜缘微环境稳态和上皮再生中的作用。尽管如此，这项研究为深入理解角膜缘微环境稳态的维持机制奠定了重要基础，未来进一步开展体内模型研究和功能实验，将有助于更全面地揭示 LEPC - sEV 在角膜组织稳态和再生中的特殊作用，为角膜相关疾病的治疗提供新的思路和潜在靶点。
