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为解决硫酸多粘菌素 B（PMBS）在动物源性食品中残留带来的食品安全问题，来自中国的研究人员开展了针对 PMBS 的 ssDNA 适配体筛选及应用研究。他们通过 Capture-SELEX 法获得适配体，确定 PMBS24 亲和力最高，Kd为 3.89±0.46 μM，且应用于 CRISPR/Cas14a 传感器检测效果良好，填补了检测空白，为适配体应用开拓新可能。
硫酸多粘菌素 B（PMB）是一种强效抗生素，其硫酸盐形式硫酸多粘菌素 B（PMBS）被广泛应用。当 PMBS 用作兽药时，过量使用会导致动物体内药物残留，这是一个重大的食品安全问题，引发了严重关注。因此，迫切需要加强这一领域的研究。在本研究中，研究人员利用 Capture-SELEX 方法获得了针对 PMBS 的单链 DNA（ssDNA）适配体，该方法在小分子筛选方面具有显著优势。随后，研究人员将获得的适配体与基于 CRISPR/Cas14a 系统的生物传感器相结合，进行了一系列验证。
在本研究中，研究人员通过 Capture-SELEX 过程发现了针对 PMBS 的特异性适配体。筛选过程共进行了十轮。研究人员利用等温滴定量热法（ITC）测定候选序列的亲和力，最终确定了亲和力最高的 PMBS24 适配体，其解离常数（Kd）为 3.89±0.46 μM。为了进一步获得高亲和力的适配体，研究人员尝试对 PMBS24 适配体进行截短。然而，结果表明，全长序列的适配体表现出更优越的亲和力。随后，该适配体被应用于基于 CRISPR/Cas14a 的传感器中，用于检测 PMBS。该方法的检测限为 0.99 ng/mL，具有良好的特异性，并成功应用于牛奶中的检测。
研究人员成功获得了 PMBS 的重要识别元件，填补了 PMBS 检测领域的部分空白。此外，该适配体已应用于基于 CRISPR/Cas14a 的传感器中，用于无需扩增的 PMBS 检测，取得了良好的检测结果。这也为该适配体应用于其他类似传感器开辟了可能性。
多粘菌素是由多粘芽孢杆菌产生的一组多肽抗生素，主要由多粘菌素 A、B、C、D 和 E 五种成分组成。PMB 以硫酸盐的形式被广泛用作药物，对一系列革兰氏阴性菌具有强大的抑制作用。当 PMBS 在兽医学中广泛使用时，很大一部分会残留在动物体内，随后可通过食用肉类、蛋类、牛奶等动物源性食品转移到人体中。然而，由于其具有显著的肾毒性和神经毒性，中国和国际上已禁止使用。中国农业农村部于 2017 年 4 月 30 日正式禁止 PMB 作为供人类食用动物的饲料添加剂。因此，目前国内外均未制定动物源性食品中 PMB 的最大残留限量（MRLs）。这种情况增加了在动物食品生产中非法或过量使用 PMB 的风险，所以密切监测动物源性食品中的 PMB 残留至关重要。
近年来，免疫分析、毛细管电泳和高效液相色谱（HPLC）一直是检测包括 PMB 在内的肽类抗生素药物残留的主要方法。这些传统方法具有高精度和可重复性的优点，但它们需要昂贵的仪器、专业人员操作，检测时间长，成本较高，并且不适合现场快速检测。目前，传感器技术已发展到较为成熟的阶段，例如电化学传感器、荧光传感器和比色传感器等。这些传感器可以克服上述缺点，具有高灵敏度，能够满足检测要求。当与相关目标的识别元件结合时，这些传感器可以进一步提高准确性，事半功倍。目前，抗生素的主要识别元件是抗体和适配体。与抗体相比，适配体具有成本低、更安全、稳定性好、易于合成和修饰的优点，同时也表现出良好的亲和力。
适配体是短的单链寡核苷酸（ssDNA 或 RNA）分子，通过体外人工筛选与特定目标结合，主要通过指数富集配体系统进化（SELEX）技术获得。在传统的 SELEX 技术中，小分子目标的亲和力明显低于大分子目标，这主要是由于缺乏用于固定的官能团，因此在小分子目标的筛选方面存在一些空白。与传统 SELEX 技术相比，Capture-SELEX 方法的限制要少得多，因为它固定的是寡核苷酸而不是目标，有效解决了传统 SELEX 中目标固定的难题。已有通过 Capture-SELEX 筛选氯霉素、青霉素、左氧氟沙星、氨基糖苷类等多种抗生素适配体的报道，但针对 PMBS 的适配体尚未开发出来。
成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）和 CRISPR 相关蛋白（Cas）系统是古细菌和细菌的适应性免疫系统。CRISPR/Cas 系统中的 CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12、CRISPR/Cas13 和 CRISPR/Cas14 已广泛应用于目标检测。由于该系统的识别目标是核酸，对于非核酸目标的检测需要与相应的识别元件结合。适配体作为识别元件已被用于该系统中检测离子、小分子、细菌、病毒等物质。Cas14 蛋白的分子量相对较小（40 - 70 kDa），仅为其他 Cas 蛋白的一半左右，结构更紧凑。与其他 CRISPR 系统（如 Cas9）相比，Cas14 的功能不需要原间隔序列邻近基序（PAM），这一特性简化了单向导 RNA（sgRNA）的设计。因此，Cas14 可以在更广泛的基因组区域内进行靶向操作。此外，通过 sgRNA 的设计，可以实现对多种目标的检测。
在本研究中，研究人员以 PMBS 为目标，采用 Capture-SELEX 技术进行筛选。研究人员选择替代序列，通过 ITC 验证其亲和力，最终筛选出一个 Kd值为 3.89±0.46 μM 的高亲和力序列，并证明了其应用于基于 CRISPR/Cas14a 的荧光传感器的可行性。此外，研究人员还评估了该传感器的灵敏度和特异性，以及其在实际样品中的应用潜力，为该适配体在其他传感器中的应用铺平了道路。
试剂和仪器：所有 DNA 序列由上海生工生物工程股份有限公司合成、表达和纯化。sgRNA 由广州碧生命科学有限公司合成和纯化。具体序列信息见表 S1 和表 S5。小分子筛选试剂盒购自合肥爱普迈生物技术有限公司。UNIQ - 10 寡核苷酸纯化试剂盒购自上海生工生物工程股份有限公司。PMBS 和多粘菌素 E 硫酸盐。
Capture-SELEX 筛选 PMBS 适配体的原理：初始的 ssDNA 文库包含 40 个随机序列，按照图 1A 所示的筛选过程进行筛选。首先将生物素标记的正向引物（Bio-Pfc）的互补序列与 ssDNA 文库杂交，然后加入链霉亲和素标记的磁珠固定文库。接着引入目标进行筛选，通过磁吸附去除未结合的 ssDNA。取少量结合的 ssDNA 进行 Q-PCR，以监测适配体的筛选过程。
结论：综上所述，本研究通过 Capture-SELEX 方法成功筛选出针对 PMBS 的特异性适配体，并将其应用于 CRISPR/Cas14a 传感器中。最初，亲和力最佳的是 PMBS24，Kd值为 3.89 μM。为了进一步提高适配体的亲和力，研究人员对 PMBS24 序列进行了不同程度的截短，结果表明，环状结构的存在是适配体识别目标的关键。最终的 Kd值比较显示，最佳......
作者贡献声明：朱鑫畅：写作 - 评审与编辑、写作 - 初稿撰写、可视化、验证、方法学、调查、形式分析、数据整理、概念构思。周家悦：形式分析、数据整理、概念构思。董梅丽：形式分析、数据整理、概念构思。王浩然：形式分析、数据整理、概念构思。陈萌萌：形式分析、数据整理、概念构思。刘林源：软件、调查、概念构思。贾丁：......
利益冲突声明：作者声明他们没有已知的可能影响本文所报道工作的竞争性财务利益或个人关系。
致谢：本研究得到了中国国家重点研发计划（2021YFA0910200）、中国国家自然科学基金（81302430）和天津市自然科学基金（18JCQNJC10800）的支持。
