AAV-RNAi 策略：靶向沉默 GNAO1 致病突变，开启脑病基因治疗新征程

为解决 GNAO1 杂合突变导致的 GNAO1 脑病问题，研究人员开展了对热点突变 GNAO1 c.607G>A（p.G203R）的功能研究及 AAV 介导的基因治疗早期开发。结果显示相关突变影响蛋白功能，设计的 RNAi 可抑制突变转录本。该研究为 AAV - RNAi 治疗 GNAO1 脑病奠定基础。

　　GNAO1（guanine nucleotide - binding protein subunit alpha - o）基因的杂合突变会引发一种极为罕见的神经发育疾病 ——GNAO1 脑病，其特征为婴儿癫痫和运动障碍。在此，研究人员对热点突变 GNAO1 c.607G>A（p.G203R）进行了功能鉴定，并开展了腺相关病毒（AAV）介导的基因治疗方法的早期开发。GNAO1 基因编码参与神经元信号传导的 Gαo 蛋白。研究表明，Gαo - G203R 在 HEK293T 细胞中丧失了增强毛喉素（forskolin）刺激的环磷腺苷（cAMP）合成的能力。在原代神经元培养中，Gαo - G203R 对神经元活动和 γ - 氨基丁酸 B 型（GABA_B）依赖的突触释放具有显性负效应。为消除突变蛋白，研究人员利用 RNA 干扰（RNAi）效应物对致病变体进行选择性沉默。他们筛选出短发夹 RNA（sh1500），它能抑制 c.607G>A 转录本，使患者特异性神经元中野生型与突变型 GNAO1 转录本的比例提高了 3.8 倍。研究人员还检测到了 sh1500 的脱靶效应，以及与 AAV 转导和 RNAi 激活相关的转录组变化。通过使用人工微小 RNA（miR1500）和神经元特异性的人突触蛋白（hSyn）启动子，研究人员改进了 AAV 构建体。对具有 “人源化” 靶序列的 Gnao1 - GGA 小鼠进行全身性 AAV9 - hSyn - miR1500 给药，未引发病理变化。重要的是，AAV9 转导了纹状体、丘脑、黑质和小脑中的 Gαo 阳性神经元，这些被确定为基因治疗的主要靶点。这些研究结果为针对显性负性 GNAO1 变体的 AAV - RNAi 方法的开发铺平了道路。