探秘结核分枝杆菌胞外囊泡：确定最低蛋白标准，开启免疫研究新征程

《Mycobacteria》：Establishment of minimum protein standards for Mycobacterium tuberculosis-derived extracellular vesicles through comparison of EV enrichment methods

为解决结核分枝杆菌胞外囊泡（MEV）缺乏纯化标准及纯度和质量评估标记的问题，研究人员开展了 MEV 富集方法比较的研究。结果表明不同方法获得的 MEV 在纯度、蛋白质组成等方面存在差异，并确定了 7 种通用蛋白。这有助于规范 MEV 研究，推动结核病相关研究进展。

　　结核病（Tuberculosis，TB）是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）引起的古老传染病，至今仍是全球公共卫生危机。在结核分枝杆菌感染过程中，其与宿主的相互作用极为复杂。结核分枝杆菌会分泌多种物质，其中胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）近年来备受关注。然而，目前对于结核分枝杆菌来源的胞外囊泡（MEV），既没有标准化的纯化方法，也缺乏评估其相对纯度和质量的标记，这严重阻碍了对 MEV 的深入研究，限制了相关诊断、治疗和预防策略的发展。

为了攻克这些难题，来自科罗拉多州立大学（Colorado State University）等机构的研究人员展开了一项极具意义的研究。他们旨在探究不同富集方法对 MEV 的影响，并确定 MEV 的最低蛋白标准。最终，该研究成果发表在《Mycobacteria》杂志上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在样本获取方面，他们在生物安全 3 级实验室培养结核分枝杆菌 H37Rv 菌株，获取培养滤液蛋白（Culture Filtrate Proteins，CFP）。之后，利用四种不同的方法对 MEV 进行富集，分别是简单超速离心（Ultracentrifugation）、基于密度梯度的超速离心（Differential Density Gradient-based Ultracentrifugation）、qEV 尺寸排阻色谱（qEV Size Exclusion Chromatography）和 CaptoCore 尺寸排阻色谱（CaptoCore Size Exclusion Chromatography）。通过纳米颗粒跟踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis，NTA）评估 MEV 的浓度和粒径分布；运用银染和蛋白质免疫印迹（Western blot）技术分析蛋白；借助透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察囊泡形态；使用质谱（Mass spectrometry）分析蛋白质组成。

在研究结果部分：

• EV 形态和大小：通过 TEM 观察发现，无论采用哪种方法富集，MEV 的大小和形态都相似，大多在 95 - 110nm 范围内，NTA 检测结果也显示不同方法获得的 MEV 粒径无显著差异。这表明 MEV 的形态和大小不受富集方法的显著影响。
• EV 富集的纯度和可重复性：不同富集方法获得的 MEV 在蛋白质回收率和颗粒回收率上存在差异。CaptoCore 富集的 MEV（CC - MEV）蛋白质回收率最高，qEV 富集的 MEV（qEV - MEV）和基于密度梯度富集的 MEV（DG - MEV）纯度最高。从可重复性来看，CC 和 qEV 方法的技术重复性优于超速离心方法，而 DG 方法在生物重复性上表现较差。
• 分析特定蛋白质标记：对 LpqH、SodC、GlcB 和 GroES 等蛋白质进行分析，发现不同方法富集的 MEV 中这些蛋白质的含量不同。例如，CC - MEV 中 LpqH 和 SodC 的含量较高，而 DG - MEV 中这两种蛋白质含量较低；同时，DG 和 qEV 方法获得的 MEV 中污染蛋白 GlcB 和 GroES 的含量最低，说明这两种方法获得的 MEV 纯度更高。
• 可视化蛋白质变化：银染和蛋白质免疫印迹结果与质谱分析一致，进一步证实 DG 和 qEV 方法能有效减少污染蛋白，获得更高纯度的 MEV。
• 全局蛋白质分析：研究人员通过分析不同方法获得的 MEV 中共享的蛋白质，确定了 7 种在所有方法获得的 MEV 中都存在的蛋白质，分别是 Sec 非依赖性膜结合双精氨酸转运酶 TatA（Rv2094c）、周质磷酸盐结合脂蛋白 PstS3（Rv0928）、肝素结合血凝素 HBHA（Rv0475）、脂蛋白抗原 LprG（Rv1411c）和 LpqH（Rv3763）、保守的 13E12 重复蛋白家族成员 P95201（Rv0393）以及结核菌素相关肽 Rv0431（P96277）。

在结论和讨论部分，研究表明虽然 MEV 的大小和外观不受富集方法影响，但不同方法在 MEV 纯度和富集程序的可重复性方面存在显著差异。qEV 和 DG 方法能获得纯度最高的 MEV，且 qEV 和 CC 方法的可重复性更好。此外，确定的这 7 种蛋白质可作为评估 MEV 制备的标准，有助于规范 MEV 研究，为进一步探究 MEV 在结核病免疫调节中的作用奠定基础，推动结核病相关研究的发展，对未来结核病的诊断、治疗和预防策略的制定具有重要意义。