编辑推荐：
本文聚焦比较肿瘤学在小分子药物开发中的应用。通过 CB-5339、KPT-335（verdinexor）、PAC-1 三个案例，展示其如何补充传统临床前数据，为人类癌症药物研发提供关键数据，助力药物获批，为抗癌药研发开辟新路径。
比较肿瘤学在小分子药物开发中的重要性
在癌症研究和药物开发领域，比较肿瘤学正发挥着日益关键的作用。它主要研究伴侣动物（如宠物狗）自然发生的癌症，能为药物研发提供独特且补充性的数据。与传统药物开发流程相结合，比较肿瘤学可从多方面助力新药的研发与审批。
药物开发通常包括确定药物安全性、耐受性、疗效以及药物对目标生物学的作用机制等关键环节。传统流程先是通过分析人类癌症患者的大规模基因组、转录组和临床数据，确定癌症相关的关键靶点，接着药物化学团队设计一系列分子，筛选出有潜力的候选药物进行体外实验。随后，在动物模型上进行临床前研究，评估药物的体内特性，最后进入人体临床试验，由监管部门审查决定药物是否获批。
比较肿瘤学研究主要以宠物狗为对象，其优势在于狗和人类存在共享的肿瘤生物学特征，研究结果具有高度的互补性。狗的肿瘤是自然发生的，在免疫健全的宿主中发展，这为研究药物在体内的靶点调节、耐受性、药代动力学 - 药效学（PK - PD）关系提供了绝佳机会。同时，还能通过狗的研究发现新的生物标志物，确定对药物有反应的组织学类型，为后续的人类研究提供重要参考。
CB-5339 在犬类实体瘤和血液恶性肿瘤中的评估
临床前研究
AAA（ATPases Associated with diverse cellular Activities）ATP 酶 p97，又称 VCP（valosin - containing protein），在泛素蛋白酶体系统（UPS）中发挥着重要作用，负责将特定蛋白质转运到蛋白酶体进行降解。随着蛋白酶体抑制剂用于治疗多发性骨髓瘤，靶向蛋白质稳态已成为一种临床验证的抗癌策略。然而，蛋白酶体抑制剂存在耐药性高和如周围神经病变、血小板减少等毒性问题，促使研究人员开发新的策略。
CB-5339 作为第二代 VCP 抑制剂，与前一代 CB-5083 相比，在体外和体内都具有相似的效力，但在理化性质、药物代谢和药代动力学方面表现更优。在多种临床前模型系统中，CB-5339 和 CB-5083 对血液恶性肿瘤（如急性髓细胞白血病（AML）和多发性骨髓瘤（MM））的疗效得到了验证。研究表明，它们能够诱导内质网（ER）应激和未折叠蛋白反应（UPR），进而杀死癌细胞，这种敏感性在患者来源的样本和细胞系中均得到证实。
在准备进行犬类临床试验时，研究人员利用 CB-5083 和 CB-5339 对犬癌细胞系进行了体外敏感性测定，并开展了犬源肿瘤小鼠异种移植研究，以优化与试验相关的药效学（PD）检测，并确认药物疗效。基于 VCP 的作用机制，选择了与 VCP 作用密切相关的 PD 标志物，如当 VCP 被抑制时，细胞质中会积累蛋白酶体特异性（K48）泛素化蛋白，同时诱导 ER 应激和 UPR，导致处理细胞的核部分中转录因子 CHOP 的表达增加。此外，在比格犬中进行的研究确定了 CB-5339 的无不良事件水平（NOAEL）为 7.5mg/kg/ 天，最大耐受剂量（MTD）为 10mg/kg/ 天。
比较肿瘤学试验
该试验旨在探究 CB-5339 治疗患有自发性恶性肿瘤（包括多发性骨髓瘤）的犬的安全性、药代动力学和药效学调节特征，以及口服 CB-5339 的可耐受暴露量与 UPR 激活和临床疗效之间的相关性。
研究采用了 22 天为一个周期的给药方案，在第 1 - 4 天和第 8 - 11 天每天口服给药一次，随后停药一周。在给药前、给药后特定时间点（第 1 - 2 天的 1 小时、6 小时、24 小时，第 8 天以及第 22 天若出现疾病稳定或进展（SD/PD）时）进行肿瘤活检，并收集外周血单个核细胞（PBMCs）。在第 1 周期的第 1 天给药前和给药后 30 分钟、1 小时、2 小时、3 小时、6 小时、24 小时采集血液样本用于药代动力学分析。通过验证的 K48 免疫测定和 qPCR 方法检测肿瘤组织和 PBMCs 中的 PD 反应，以确定 UPS 的参与情况，并将其与匹配时间点的药代动力学数据关联，探索 PK/PD 关系。
在为期 2 年的研究中，共招募了 24 只患有多种恶性肿瘤的宠物犬，评估了两种不同的药物配方（活性药物成分（API）以游离碱粉末形式装在胶囊中与人类临床配方）。结果显示，CB-5339 总体耐受性良好，但存在一些不良事件，主要与胃肠道反应（食欲不振、恶心、呕吐）有关。通过逐步增加剂量和调整给药方案，确定最大耐受剂量为 7.5mg/kg，每周连续给药 4 天，停药 3 天，连续给药 3 周。PK/PD 数据表明，药物暴露量与 UPR 诱导相关靶点的调节存在关联，但与药物耐受性无关。在患有多发性骨髓瘤的犬中，33%（2/6）的犬出现了疗效信号，这与药物诱导蛋白质毒性应激的作用机制相符，因为多发性骨髓瘤是一种蛋白质产生丰富的肿瘤类型。试验方案的灵活性使得研究人员能够探索 2 周和 3 周的暴露方案。
对人类应用的启示
CB-5339 由 Cleave Therapeutics 和美国国家癌症研究所的新型和实验性治疗（NExT）计划联合开发。通过犬类试验，研究人员发现 PBMCs 不适合作为监测体内 PD 反应的肿瘤组织替代物，这对该药物在人类试验中的样本采集计划具有直接影响；同时，肿瘤组织活检过程中的医源性出血会干扰某些 PD 检测结果，提示未来试验应考虑其他检测方法。犬类多发性骨髓瘤中观察到的疗效信号，激发了人们对该药物许可进行持续临床开发的热情，并推动了其在血液恶性肿瘤患者中的首次人体试验。在一项针对急性髓细胞白血病和骨髓增生异常综合征患者的 1 期临床试验中，55 名患者对该药物耐受性良好，并显示出临床活性（NCT04402541）。目前，针对 CB-5339 在 AML 和 MM 患者中的更多临床试验正在计划中，CASI Pharmaceuticals 继续推进该药物的临床开发。
KPT-335（verdinexor）在犬类实体瘤和淋巴瘤中的评估
临床前研究
XPO1 是一种核输出蛋白，通过将数百种蛋白质和多种 RNA（如 mRNA、microRNA 等）转运出细胞核，调节广泛的细胞过程。已知多种肿瘤抑制因子和生长调节蛋白（如 p53、p21 等）是 XPO1 的底物，XPO1 的异常表达会导致这些蛋白质的异常定位，促进肿瘤的发生和发展。在多种人类癌症（包括癌、肉瘤和血液恶性肿瘤）中，XPO1 的过表达与不良预后相关。因此，靶向 XPO1 被认为在多种肿瘤治疗中具有潜在价值。
XPO1 小分子抑制剂的研发始于 20 世纪 80 年代，最早的是 leptomycin B，它在体外和小鼠肿瘤模型中显示出抗肿瘤活性，但在人体 1 期试验中，由于临床活性低且副作用（如不适、厌食）严重，试验提前终止。随后开发的 leptomycin B 类似物虽然效力增强且毒性降低，但静脉给药的限制阻碍了其临床发展。为解决这些问题，Karyopharm Therapeutics 设计了新型、类药、口服生物可利用的小分子核输出选择性抑制剂（SINE），如 KPT-335（verdinexor）和 KPT-330（selinexor）。它们能与 XPO1 的反应性位点 Cys 528 残基结合，导致 XPO1 功能失活和短暂的蛋白酶体介导的降解。SINE 在多种癌细胞系和小鼠癌症模型中均显示出诱导细胞凋亡和抑制增殖的作用，且在小鼠中具有良好的口服生物利用度和耐受性。
在进行犬类研究之前，研究人员使用原代肿瘤细胞和肿瘤细胞系，对几种 SINE（KPT185、KPT-214 和 KPT-335）在犬类癌症中的生物活性进行了体外研究。结果显示，KPT-185 和 KPT-335 在低纳摩尔浓度下就能降低弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）犬细胞系 CLBL1 以及原发性犬 DLBCL 样本的活力；KPT-214 抑制犬肥大细胞瘤、骨肉瘤和黑色素瘤细胞系的生长，IC50值在 70 - 450nM 之间。对 KPT-335 的体外研究进一步扩展到更多的犬黑色素瘤细胞系，发现其 IC50值在 71 - 330nM 之间，能够抑制集落形成，促进 p53 和 p21 的上调和核定位，并诱导黑色素瘤细胞系凋亡。此外，在犬骨肉瘤、乳腺癌和移行细胞癌肿瘤细胞系中，KPT-335 也表现出剂量依赖性的生长抑制作用，激活 caspase 3 和 7，增强 p53 和 p21 的表达，并促进 p53 的核定位。
在开始对客户拥有的犬进行研究之前，研究人员在健康比格犬中进行了 KPT-335 的药代动力学初步评估。给犬喂食 1.5mg/kg 的药物后，在 48 小时内采集血液样本进行分析，结果显示平均 Tmax约为 4 小时，Cmax约为 250ng/ml，平均 AUC 为 1800ng/ml，表明该剂量足以抑制靶点。随后的靶动物安全性研究证实，犬口服 KPT-335 后吸收良好，1 - 3mg/kg 的剂量可使其达到治疗水平（>0.5 - 1.0μM）。
比较肿瘤学试验
该试验旨在研究 KPT-335 在患癌犬中的安全性、药代动力学和生物学活性，以及探索减轻 XPO1 抑制相关不良事件的策略。
研究采用标准的 3 + 3 1 期临床试验设计，对患有淋巴瘤、肥大细胞瘤或骨肉瘤的犬进行研究，以确定最大耐受剂量和药物相关毒性。如果在特定肿瘤类型 / 剂量下观察到安全性和生物学活性，则计划进行队列扩展。在此基础上，开展了针对未经治疗和复发的 B 或 T 细胞淋巴瘤犬的 2 期临床试验，并对部分犬进行药代动力学分析。
在 1 期研究中，共招募了 17 只患有淋巴瘤（未经治疗或复发）、肥大细胞瘤或骨肉瘤的犬。确定 KPT335 的最大耐受剂量为 1.75mg/kg，每周 3 次，在 1mg/kg 时就观察到了生物学活性。在淋巴瘤犬中，部分犬出现了临床获益，包括部分缓解（PR，n = 2）和疾病稳定（SD，n = 7），持续时间为 35 - 256 天。基于这些结果，增加了 6 只淋巴瘤犬的队列扩展，使用 1.5mg/kg KPT-335，每周 3 次给药，4 只犬出现临床获益，持续时间为 35 - 354 天。观察到的不良事件包括厌食、体重减轻、呕吐和腹泻，通过支持性护理、剂量调整和给予低剂量泼尼松刺激食欲等方法进行管理。生活质量指标工具显示，犬的生活质量得以维持。
在 2 期研究中，在 10 个不同的研究地点共招募了 58 只未经治疗或复发的 B 细胞或 T 细胞淋巴瘤犬。KPT-335 以三种给药组（1.5mg/kg，每周 3 次；1.25mg/kg，每周 3 次；1.25 - 1.5mg/kg，每周 2 次）口服给药。在可评估的患者群体中，所有犬的客观缓解率（CR/PR）为 37%（20/54），T 细胞淋巴瘤犬的客观缓解率更高（71%）。所有剂量组中最常见的不良事件与 1 期研究一致（厌食、体重减轻、呕吐、嗜睡和腹泻），通过剂量调整和低剂量泼尼松可进行管理。对 7 只接受 1.5mg/kg（n = 4）或 1.25mg/kg（n = 3）KPT-335，每周 3 次给药的犬进行药代动力学分析，结果显示平均 Cmax为 278ng/ml，平均 AUC 为 1970.6ng*t/ml，Tmax为 5.3 小时，T1/2为 5 小时，两种剂量均达到了足以抑制 XPO1 的血浆水平。
对人类应用的启示
犬类研究证实了 KPT-335 在血液恶性肿瘤（淋巴瘤）中的生物学活性信号，确定了可耐受的给药方案（每周 2 次），并确定了减轻 SINE 化合物使用相关毒性的有效策略。KPT-335（verdinexor）在患有肿瘤的宠物犬中获得美国 FDA - CVM 有条件批准，商品名为 Laverdia - CA1，其安全性数据作为补充信息纳入了 FDA 对 selinexor 的初始新药研究申请中。犬类研究确定了 XPO - 1 抑制相关的主要毒性（恶心、呕吐、食欲减退）、减轻这些不良事件的策略（与抑制剂同时使用类固醇）以及给药方案（每周两次）。这种联合类固醇的给药策略在随后 selinexor 用于人类弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（DLBCL）患者的临床试验中得到应用，并促使 FDA 在 2020 年加速批准 selinexor 用于该疾病的治疗。目前，KPT-330（XPOVIO，selinexor）已被 FDA 批准用于治疗复发的多发性骨髓瘤（2019 年）和弥漫性大 B 细胞淋巴瘤（2020 年）。
PAC-1 疗法在犬类中枢神经系统恶性肿瘤中的评估
临床前研究
procaspase - 3（PC - 3）切割为 caspase - 3 是内源性和外源性细胞凋亡级联反应中的关键节点，caspase - 3 作为执行蛋白酶，能够催化数百种蛋白质底物的水解，最终导致细胞死亡。肿瘤细胞常常通过突变和调节凋亡蛋白来逃避程序性细胞死亡，从而获得生存优势。因此，许多抗癌策略聚焦于小分子抑制这些突变蛋白，以重新激活癌细胞对凋亡信号的敏感性。另一种互补的策略是通过小分子激活促凋亡蛋白，如 PC - 3。由于 PC - 3 在凋亡级联反应中的下游位置，其在癌症中的突变较少，且在多种造血和实体肿瘤组织中均有较强表达，因此，小分子介导的 PC - 3 激活被认为是一种合理且创新的抗癌策略。
2006 年，首个 procaspase 激活化合物（PAC - 1）通过高通量筛选被发现。经过一系列化学合成、体外细胞培养和体内实验，研究人员发现 PAC - 1 类化合物是一种有前景的抗癌策略。PAC - 1 是一种能够穿透血脑屏障的小分子，可激活 PC - 3，在多种临床前啮齿动物肿瘤模型中，具有良好的药代动力学、耐受性，并且与传统治疗方法联合使用时具有协同作用。在大鼠和小鼠肿瘤实验中，PAC - 1 能够显著增强全身化疗、电离辐射、小分子抑制剂和新型促凋亡诱导剂的细胞杀伤活性。
为加速推进 PAC - 1 进入人类 1 期临床试验，研究人员在健康研究犬和患有自然发生癌症的宠物犬中对其进行了系统评估。给健康比格犬每日口服 PAC - 1，结果显示其具有可预测的口服生物利用度和药代动力学，且不会引起血液学或生化毒性。在比格犬中进行的临床前新药研究数据确定，PAC - 1 的 NOAEL 为 6.5mg/kg/ 天，每个治疗周期连续给药 21 天，随后停药 7 天，重复 3 个周期。重要的是，在啮齿动物和犬中可达到的 PAC - 1 血浆峰值浓度（~10μM）与体外足以选择性诱导 PC - 3 过表达癌细胞系死亡的浓度（≤10μM）相当。在患有自发性癌症的宠物犬中，每日口服 10mg/kg（范围 7.5 - 12.5mg/kg）的 PAC - 1，与最大耐受剂量的全身化疗药物（多柔比星、替莫唑胺或羟基脲）或电离辐射联合使用，在 T 细胞淋巴瘤、转移性骨肉瘤、胶质瘤和脑膜瘤等疾病的治疗中进行了评估。
鉴于 PAC - 1 良好的血脑屏障穿透特性，研究人员聚焦于其在治疗各种脑癌恶性肿瘤中的更广泛应用，特别是利用宠物犬自然发生的脑肿瘤，对 PC - 3 激活策略进行研究。为此，研究人员对 650 个人类和犬类脑肿瘤样本进行了大规模验证，评估了 PC - 3 作为药物靶点的可行性；研究了 PC - 3 表达在胶质肿瘤中的预后意义；测试了永生化胶质瘤细胞系在生物学可实现条件下对 PAC - 1 的敏感性；以及在颅内 GL261 小鼠模型中评估了 PAC - 1 单独使用和与电离辐射联合使用的细胞杀伤活性。通过对患有胶质瘤或脑膜瘤的宠物犬进行初步可行性研究，结果显示 PAC - 1 与包括电离辐射、替莫唑胺和羟基脲在内的多模式疗法联合使用具有良好的耐受性。
比较肿瘤学试验
该试验旨在探究口服 PAC - 1 与包括电离辐射和全身化疗在内的联合疗法，在患有自发性恶性<
