多转录组学揭示胶质母细胞瘤（GBM）的肿瘤微环境特异性表达程序及内皮细胞特征

《Journal of Translational Medicine》：Multi-transcriptomics reveals niche-specific expression programs and endothelial cells in glioblastoma

为解决胶质母细胞瘤（GBM）中假栅栏状坏死细胞（PAN）和微血管增殖（MVP）区域的分子和细胞异质性及空间特征未明的问题，研究人员开展多转录组学研究。结果发现了区域特异性转录程序等，为 GBM 进展提供了细胞和分子层面的见解。

　　在大脑这个神秘的 “城堡” 里，有一种极其凶险的 “敌人”—— 胶质母细胞瘤（Glioblastoma，GBM）。它是一种高度恶性的颅内肿瘤，就像一颗疯狂生长的 “毒瘤”，严重威胁着患者的生命健康。GBM 在病理上有两个显著的特征，即围绕坏死区域的假栅栏状细胞（Pseudopalisading cells around necrosis，PAN）和微血管增殖（Microvascular proliferation，MVP），这两个特征也是它区别于低级别胶质瘤的重要标志，同时预示着极差的预后。然而，尽管科研人员在 GBM 的研究上不断探索，但这两个标志性区域的分子和细胞异质性，以及它们的空间特征，至今仍像迷雾一样未被完全揭开。这就好比在黑暗中摸索，找不到准确的方向，极大地限制了 GBM 的诊断和治疗发展。为了驱散这片迷雾，中国科学技术大学苏州生物医学工程技术研究所等机构的研究人员踏上了探索之旅。他们开展了一项综合多转录组学的研究，旨在深入剖析 GBM 中这些特殊区域的奥秘。最终，研究取得了重要成果，为理解 GBM 的进展提供了关键的细胞和分子层面的见解，这一成果发表在《Journal of Translational Medicine》上。
研究人员运用了多种关键技术方法。他们整合了来自多个数据库的数据集，包括 Ivy Glioblastoma Atlas Project（IvyGAP）的 RNA 测序数据、利用 Visium 技术产生的空间转录组数据、来自 GEO 数据库的 Smart-seq2 胶质母细胞瘤单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）数据，以及从 UCSC Xena 浏览器获取的癌症基因组图谱（TCGA）GBM 数据集。同时，使用了多种生物信息学分析方法，如差异基因表达分析、空间转录组分析、反卷积分析等，还结合了免疫荧光和 RNA 分离及 qPCR 实验技术。
研究结果如下：

1. 解剖转录组分析揭示 PAN 和 MVP 的分子差异：研究人员整合多种转录组数据集进行分析。在 Ivy-GAP 数据集中，对比不同区域的基因表达谱发现，PAN 和 PNZ 区域促血管生成基因表达升高，HBV 和 MVP 区域内皮及干性相关基因高表达，且 MVP 区域肿瘤发生和迁移相关分子表达增加。通过差异基因分析，还发现了 PAN 和 MVP 各自特有的上调基因，这些基因参与的生物学过程不同，暗示细胞在这两个区域具有高恶性，且细胞间粘附减少，有助于肿瘤的侵袭和进展。
2. 鉴定 PAN 和 MVP 的区域特异性标记基因：运用 Seurat 和 SpaGCN 软件包在 10X Visium 数据集中识别空间可变基因（SVGs），整合分析后得到了 PAN 和 MVP 的候选标记基因。这些基因大多与肿瘤细胞的迁移、侵袭、干性和血管生成相关。通过对 TCGA RNA 测序数据的分析，发现多数标记基因在 GBM 中高表达，且与患者预后不良相关，表明这些基因的空间上调可能促进 GBM 的恶性进展。
3. PAN 和 MVP 标记基因的空间定位：以 UFK243 样本为例，研究人员发现不同的 PAN 和 MVP 标记基因在肿瘤组织的不同区域呈现出特异性的表达模式。原位杂交和免疫荧光实验进一步验证了这些基因在 PAN 和 MVP 区域的表达差异，确认了所获得的区域特异性标记基因的准确性。
4. 确定空间转录组 GBM 中的细胞类型组成：通过对整合数据进行 UMAP 降维可视化和无监督聚类分析，并结合 SingleR 注释和手动校正，研究人员鉴定出 GBM 微环境中存在 9 种主要细胞类型。分析 PAN 和 MVP 标记基因在不同细胞类型中的表达情况，发现它们在成纤维细胞和内皮细胞中的表达差异最为显著，提示这些细胞在 PAN 和 MVP 的组织学特征中可能发挥不同作用。
5. 探索人胶质母细胞瘤中多样的内皮细胞：研究发现 PAN 和 MVP 标记模块得分呈现相对独立的分布，表明这两个区域的内皮细胞具有不同的表达模式和功能状态。通过无监督聚类和差异表达分析，鉴定出 PAN 和 MVP 相关内皮细胞的特征性表达基因，功能富集分析显示它们分别在缺氧反应和细胞粘附、血管生成等途径中发挥重要作用。体外实验也验证了这些基因在相应区域的表达情况。
6. 胶质母细胞瘤干细胞（GSCs）向内皮细胞的分化：分析多个 GBM scRNA-seq 数据集发现，许多 PAN/MVP 标记基因在 GSCs 和内皮细胞中高表达。通过可视化配体 - 受体对、空间热图、假时间分析和双免疫荧光实验，揭示了 GSCs 和内皮细胞之间存在相互作用，且 GSCs 具有向内皮细胞分化的轨迹，这一结果与已有研究中 GSCs 可分化为肿瘤血管内皮的观点相符。
   研究结论和讨论部分指出，该研究揭示了 GBM 中 PAN 和 MVP 区域存在两种不同表型的内皮细胞，PAN 相关内皮细胞具有与 GBM 细胞相似的拷贝数变异，且 GSCs 存在向内皮细胞分化的假时间轨迹。这些发现为 GBM 的进展提供了深入的细胞和分子层面的理解，有助于更深入地认识 GBM 的发病机制，为开发更有效的诊断和治疗策略提供了重要依据。同时，研究也指出尽管取得了这些成果，但差异表达基因的生物学意义还需要进一步的功能验证，未来的研究可以在此基础上继续探索，有望为 GBM 患者带来新的希望。