一种保守的真菌效应子干扰 Ca2+感知和 ROS 稳态诱导植物细胞死亡：水果采后病害防治新视角

《Nature Communications》：A conserved fungal effector disturbs Ca2+ sensing and ROS homeostasis to induce plant cell death

在植物病理学研究中，为探究病原菌操纵宿主细胞致病的机制，重庆大学等机构的研究人员对真菌效应子展开研究。他们发现 PdCDIE1 可干扰 CaM - 靶标结合，引发 ROS 依赖的植物细胞死亡，这为理解病原菌感染机制提供新视角，对防治植物病害意义重大。

　　在植物与病原菌的 “战争” 中，病原菌总是想尽办法入侵植物，给全球粮食安全带来巨大威胁。植物病害引发的饥荒在人类历史上屡见不鲜，即便在现代，由致病微生物引起的植物疾病依然是农业生产的大敌。水果富含营养，是人们饮食的重要组成部分，但采后病害却让水果在储存和运输过程中大量腐烂，造成严重的经济损失。例如，柑橘作为全球广泛种植和消费的水果，常受到采后真菌病原菌的侵害，其中柑橘绿霉病菌（Penicillium digitatum，Pd）引起的柑橘采后绿霉病，是导致柑橘果实腐烂的主要因素，可造成高达 90% 的损失。

在植物应对病原菌的过程中，钙离子（Ca²⁺）信号起着关键作用，它是植物体内重要的第二信使，参与众多生物学过程，尤其是植物对环境胁迫的响应。钙调蛋白（Calmodulin，CaM）作为主要的 Ca²⁺传感器，能激活靶蛋白，调节细胞的各种活动。然而，近年来研究发现，Ca²⁺信号通路中的一些成分不仅参与植物的免疫反应，还与植物的免疫抑制或感病性有关。此外，病原菌会分泌一系列效应子（effector）来干扰植物的免疫信号或操纵植物的其他生理过程，从而导致效应子触发的易感性（effector - triggered susceptibility，ETS）。虽然目前已经鉴定出许多抑制植物免疫的效应子，但对于病原菌效应子如何操纵植物非免疫相关过程，我们的了解还十分有限。特别是在水果与病原菌的相互作用中，毒力效应子在采后病害中的作用机制几乎还是一片空白。

为了深入探究病原菌感染水果的机制，重庆大学、周口师范学院、西北农林科技大学等机构的研究人员展开了一项重要研究。他们从柑橘绿霉病菌（Pd）中鉴定出一种进化上保守的效应子 PdCDIE1（Penicillium digitatum Cell Death - Inducing Effector 1），并对其调节植物细胞死亡的具体机制进行了深入研究。该研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解病原菌与水果的相互作用提供了全新的视角，对防治植物病害具有重要意义。

研究人员运用了多种关键技术方法来开展这项研究。在基因功能验证方面，采用农杆菌介导的瞬时表达技术，将相关基因导入烟草（Nicotiana benthamiana）、番茄（Solanum lycopersicum）、柑橘（Citrus sinensis）和苹果（Malus domestica）等植物中，观察其对植物细胞死亡的影响；利用定量逆转录聚合酶链反应（qRT - PCR）分析 PdCDIE1 在不同感染阶段的转录水平。在蛋白相互作用研究中，运用免疫共沉淀（Co - IP）、酵母双杂交（Y2H）和体外 Pull - down 等实验技术，确定 PdCDIE1 与植物蛋白的相互作用关系；通过亚细胞定位和双分子荧光互补（BiFC）实验，明确蛋白在细胞内的定位和相互作用情况。此外，还利用基因沉默技术，如烟草脆裂病毒（TRV）介导的基因沉默，研究相关基因在植物细胞死亡中的作用。

研究结果如下：

• 鉴定出细胞死亡诱导效应子 PdCDIE1：研究人员通过筛选在柑橘果实感染 Pd 过程中诱导表达的基因，发现 PDIP_06490 基因编码的蛋白具有明显的植物细胞死亡诱导活性，将其命名为 PdCDIE1。农杆菌介导的瞬时表达实验表明，PdCDIE1 在烟草、番茄、柑橘和苹果等不同植物物种中均能诱导细胞死亡，且其诱导的细胞死亡可通过碘化丙啶（PI）染色和电解质渗漏实验得到证实。
• PdCDIE1 在多种真菌病原菌中保守且其同源物具有细胞死亡诱导活性：BLAST 分析显示，PdCDIE1 在许多植物真菌病原菌、昆虫或人类真菌病原菌中都有同源物，表明其在进化上具有保守性。来自其他两种采后真菌病原菌的 PdCDIE1 同源物，在烟草、柑橘和苹果果实中也能诱导细胞死亡，这突出了 PdCDIE1 及其同源物在诱导植物细胞死亡方面的保守活性。
• PdCDIE1 是一种细胞质效应子：酵母信号陷阱实验和免疫印迹实验证实，PdCDIE1 含有 N 端信号肽，在 Pd 感染柑橘果实时能够分泌。亚细胞定位实验表明，PdCDIE1 定位于植物细胞质中，且其 N 端的一个 42 氨基酸区域可能介导其进入植物细胞。
• PdCDIE1 对 Pd 在柑橘果实中的毒力至关重要：qRT - PCR 分析显示，PdCDIE1 在 Pd 感染柑橘果实的过程中表达量显著增加。敲除 PdCDIE1 基因后，ΔPdCDIE1 突变体在柑橘果实中的毒力明显减弱，植物细胞死亡程度降低，这表明 PdCDIE1 对 Pd 的毒力贡献显著。
• PdCDIE1 与植物热休克蛋白 Hsp70 相互作用：通过免疫沉淀 - 质谱（IP - MS）、酵母双杂交、体外 Pull - down、亚细胞定位、BiFC 和 Co - IP 等实验，研究人员证实 PdCDIE1 与植物热休克蛋白 Hsp70（Heat Shock Protein 70）在植物细胞质中相互作用。
• Hsp70 拮抗 ROS 依赖的植物细胞死亡：研究发现，ROS 是 PdCDIE1 触发植物细胞死亡所必需的，清除 ROS 可抑制细胞死亡。沉默 Hsp70 基因会导致植物生长受损、叶片细胞死亡和 ROS 积累增加，而过表达 Hsp70 则能抑制 PdCDIE1 触发的细胞死亡，表明 Hsp70 拮抗 ROS 依赖的植物细胞死亡。
• Hsp70 含有 CaM 结合结构域，是 CaM 的真正靶标：Y2H、体外肽结合实验和 Co - IP 实验表明，Hsp70 含有 CaM 结合结构域（CaM - binding domain，CBD），能与 CaM 在 Ca²⁺依赖的方式下相互作用，说明 Hsp70 是 CaM 的真正靶标。
• N 端 PdCDIE1 与 Hsp70 的 CaM 结合结构域相互作用：Y2H、体外 Pull - down 和 Co - IP 等实验表明，N 端 PdCDIE1 与 Hsp70 的 CaM 结合结构域相互作用，且这种相互作用不依赖于 Ca²⁺。
• Pd 感染干扰柑橘果实中 CaM 与 Hsp70 的相互作用，而 ΔPdCDIE1 突变体感染可恢复该相互作用：Co - IP 实验显示，在 Pd 感染柑橘果实时，由于 PdCDIE1 与 CaM 竞争结合 Hsp70，导致 CaM 与 Hsp70 的相互作用减弱；而在 ΔPdCDIE1 突变体感染时，这种相互作用得以恢复。
• 应用 CaM 抑制剂和沉默 CaM 基因诱导植物细胞死亡和高水平 ROS：应用 CaM 抑制剂三氟拉嗪（trifluoperazine）和沉默 CaM 基因，均可干扰 CaM - Hsp70 的结合，诱导植物细胞死亡和高水平的 ROS 产生，这与 PdCDIE1 的作用效果相似。

研究结论和讨论部分指出，PdCDIE1 是一种对 Pd 毒力至关重要的植物细胞死亡诱导效应子，它通过与植物细胞质中的 Hsp70 相互作用，干扰 CaM - Hsp70 的结合，导致 ROS 稳态失衡，进而引发植物细胞死亡。这一发现为理解病原菌如何操纵植物细胞死亡提供了新的机制，揭示了 Ca²⁺信号通路和 ROS 稳态在植物 - 病原菌相互作用中的重要性。此外，PdCDIE1 在不同真菌病原菌中的保守性，以及其同源物的相似功能，表明这种细胞死亡诱导机制可能在真菌病原菌中广泛存在。该研究为开发防治水果采后病害的新策略提供了理论基础，也为进一步研究病原菌与植物的相互作用开辟了新的方向。 】