一种利用长期冷冻脑肿瘤组织进行单核 RNA 测序的简化制备方法：开启肿瘤研究新视野

《Scientific Reports》：A simplified preparation method for single-nucleus RNA-sequencing using long-term frozen brain tumor tissues

在肿瘤研究中，单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）对新鲜组织的依赖限制了其在罕见组织研究中的应用。研究人员针对此问题，优化从长期冷冻小儿胶质瘤组织中分离完整细胞核的方法。结果显示该方法简单、低成本且适用于多种平台，有助于研究肿瘤异质性，意义重大。

　　在生命科学的研究领域中，肿瘤一直是备受关注的焦点，尤其是脑肿瘤，对人类健康构成了严重威胁。在儿童群体里，中枢神经系统肿瘤（比如胶质瘤）是导致癌症相关发病率和死亡率居高不下的重要原因。尽管医学领域不断努力，但针对这些肿瘤的治疗效果仍不尽人意。单细胞 RNA 测序（scRNA-seq）技术的出现，为研究肿瘤异质性和细胞群体特性带来了新的曙光。然而，这项技术在实际应用中却面临着一个棘手的问题：它大多依赖新鲜的手术标本，这使得那些极为罕见的组织类型难以进行分析研究，就像是在探索宝藏的路上遇到了一道难以跨越的鸿沟。

为了突破这一困境，来自德国多个研究机构的科研人员，包括 Hopp 儿童癌症中心海德堡（Kitz）、德国癌症研究中心（DKFZ）等，积极投身于相关研究。他们致力于优化一种从长期冷冻的小儿胶质瘤组织中分离完整细胞核的方法，进而开展单核 RNA 测序（snRNA-seq）研究。最终，他们成功开发出了一种快速、简单且低成本的细胞核分离方案，这一成果意义非凡，为肿瘤研究开辟了新的路径。相关研究成果发表在《Scientific Reports》上。

在研究过程中，科研人员运用了多种关键技术方法。首先是优化后的细胞核提取技术，从冷冻肿瘤组织中分离细胞核，通过一系列步骤确保细胞核的完整性和质量；接着采用不同的 snRNA-seq 平台，如 Chromium 10X Genomics、Drop-seq 和 Fluidigm C1 System，对提取的细胞核进行分析；还运用了生物信息学分析方法，对测序数据进行处理、质量控制、细胞聚类和差异表达分析等，从而深入探究细胞的特性和功能。

下面让我们详细了解一下具体的研究结果。

1. 从长期冷冻小儿胶质瘤组织中分离完整细胞核且收获良好：科研人员起初尝试了 Spalding 等人（2005）开发并经 Ernst 等人（2014）修改的密度梯度离心法，但使用冷冻人脑肿瘤组织时，最终制备物中出现了大量细胞碎片且细胞核产量较低。之后，他们对缓冲液、匀浆程度、过滤步骤和超速离心步骤等进行了一系列优化，还测试了多种耗材塑料、包被缓冲液和缓冲液体积。最终确定的优化方案操作简便，总时长不到 30 分钟，成本低廉。该方案能分离出完整、无损伤且无细胞碎片的细胞核，线粒体映射读数比例极低，为后续研究提供了优质的样本。
2. 使用患者来源的异种移植物比较平台研究肿瘤异质性：科研人员利用 Chromium 10X Genomics、Drop-seq 和 Fluidigm C1 系统分析小儿胶质母细胞瘤患者来源的异种移植物（PDX）样本。结果表明，不同平台在覆盖读取比例、检测到的细胞核数量和基因数量等方面存在差异，但都能清晰区分小鼠和人类细胞核。通过对 PDX 样本的分析，还鉴定出了不同的细胞群体，包括循环细胞、前神经样（PN 样）细胞、星形胶质细胞样（AC 样）细胞和少突胶质细胞前体样（OPC 样）细胞，并揭示了它们之间的分化关系。
3. 新鲜冷冻原发性肿瘤组织的单核 RNA 测序揭示了不同的肿瘤和健康细胞群体：利用 10X snRNA-seq 系统对四个长期冷冻的原发性小儿胶质瘤组织进行分析。结果显示，不同测序设备对聚类检测影响不大，足够的测序深度对识别不同细胞群体更为重要。在不同类型的胶质瘤样本中，如毛细胞型星形细胞瘤（PA）和小儿高级别胶质瘤（HGG），鉴定出了多种肿瘤细胞群体和健康细胞群体，如 OPC 样肿瘤细胞、AC 样肿瘤细胞、小胶质细胞和内皮细胞等。此外，加入短片段文库进行联合分析，能更详细地注释细胞类型，发现更多差异表达基因。
4. 拷贝数变异分析支持从 10X snRNA-seq 数据中检测肿瘤细胞：尽管 10X Genomics 系统在检测基因组拷贝数方面存在挑战，但 inferCNV 工具对 10X snRNA-seq 数据的分析取得了有前景的结果。通过将健康细胞类型簇作为内部参考，能观察到肿瘤簇中拷贝数变化的区域，与肿瘤的批量拷贝数变异（CNV）图谱相比，在某些区域具有合理的对应性，有助于注释肿瘤或基质细胞簇。

研究结论和讨论部分指出，该研究开发的从长期冷冻组织中提取完整单核的方法具有诸多优势，简单、快速、低成本，适用于大多数生物实验室。该方法获得的细胞核可应用于不同的 scRNA-seq 平台，为研究肿瘤异质性和其他生物学问题提供了丰富的资源。通过对小儿脑肿瘤组织的研究，揭示了不同的肿瘤细胞亚群和浸润的免疫细胞成分，发现了小胶质细胞的不同激活状态，为理解肿瘤与免疫细胞的关系提供了线索。此外，短片段文库的加入增强了对细胞类型的注释和对免疫细胞标记物等的洞察。总体而言，这项研究成果极大地拓展了肿瘤研究的范围，为深入探究肿瘤生物学机制和开发新的治疗策略奠定了坚实基础，有望推动肿瘤治疗领域取得新的突破。