编辑推荐：
在单粒子低温电子显微镜（cryoEM）研究中，高质量网格制备是获取高分辨率结构的瓶颈，对氧敏感蛋白（如金属蛋白）而言问题更严峻。研究人员利用 SPT Labtech chameleon 设备开发（an）aerobic 工作流程，成功测定多种氧敏感蛋白高分辨率结构，推动了结构生物学发展。
在生命科学的微观探索领域，低温电子显微镜（cryoEM）已成为解析生物大分子结构的关键技术。然而，当前高质量的 cryoEM 样本制备却困难重重，犹如一座难以翻越的大山，严重阻碍了研究的进展。对于氧敏感蛋白，像参与线粒体电子传递、光合作用和固氮等重要生命过程的金属蛋白来说，传统的样本制备方法更是雪上加霜。在有氧环境下，氧的存在会使金属蛋白中的金属簇受损，改变其氧化状态，导致蛋白失活、变性甚至聚集，使得获取准确的蛋白结构变得极为困难。目前，99% 的 EMBD（电子显微镜数据库）结构是在有氧条件下制备的，而厌氧 cryoEM 网格制备成功的案例少之又少。现有的厌氧网格制备方法，如在缺氧室中使用玻璃化设备，不仅成本高昂、操作复杂，而且温度和湿度难以精确控制，无法满足广泛的研究需求 。
为了攻克这些难题，来自美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校（University of California San Diego）的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于开发一种创新的工作流程，以实现在有氧环境下对氧敏感蛋白进行功能厌氧条件下的冷冻，从而获取高分辨率的蛋白结构。
研究人员的努力取得了丰硕的成果。他们成功地利用 SPT Labtech chameleon 设备，开发出一种名为（an）aerobic 的工作流程。通过在样本加载前、样本吸取过程中和样本沉积到自吸式 EM 网格的整个过程中，采取保护或消除氧气污染的措施，维持了样本的厌氧状态。这一工作流程的有效性在多项实验中得到了充分验证。研究人员运用该流程，成功测定了不同配体状态下脱氧人类血红蛋白（deoxyHb）以及还原态的维氏固氮菌（Azotobacter vinelandii）钼铁蛋白（MoFeP）的高分辨率 cryoEM 结构。这一成果意义重大，为深入理解氧敏感蛋白的结构与功能提供了关键的结构信息，有助于推动相关领域的进一步研究。该研究成果发表在《Nature Communications》上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：首先是样本制备技术，针对不同的蛋白样本，如人类血红蛋白（Hb）和 MoFeP，研究人员在厌氧环境下进行蛋白的还原和处理，并添加不同浓度的连二亚硫酸钠（NaDT）以维持厌氧条件；其次是利用 SPT Labtech chameleon 设备进行网格制备，通过优化设备操作参数，如调整样本吸取和分配的步骤、控制油层保护和 wicking 时间等，确保样本在制备过程中免受氧气污染；最后是 cryoEM 数据收集和处理技术，使用 Titan Krios G4 显微镜在特定条件下收集数据，并运用 cryoSPARC 等软件对数据进行处理和分析，从而获得蛋白的高分辨率结构 。
下面详细介绍研究的主要结果：
- 开发（an）aerobic 样本冷冻工作流程：研究人员选择人血红蛋白（Hb）作为模型系统，针对传统样本制备过程中氧气污染的关键阶段进行优化。在样本加载前，通过在样本顶部添加由石蜡油和硅油混合而成的保护油层（Al’s oil），减缓氧气向样本的灌注，延长样本在空气中保持脱氧状态的时间。实验表明，添加保护油层的脱氧 Hb 样本在空气中可保持脱氧状态长达 20 分钟，而未添加油层的样本氧气结合速度更快。在样本吸取过程中，针对保护油层残留影响分配效率的问题，研究人员增加了额外的分配器清洗步骤，经检验，该操作对网格制备和下游的 cryoEM 成像及数据处理均无显著影响。
- 评估（an）aerobic chameleon 工作流程：为解决样本从厌氧室转移到 chameleon 设备过程中的氧气污染问题，研究人员将油层覆盖的样本置于气密玻璃小瓶中密封运输。同时，通过优化样本沉积到网格后的 “wicking period” 和样本缓冲液中 NaDT 的浓度，研究人员对不同 NaDT 浓度下的 deoxyHb 进行结构测定。结果发现，当 NaDT 浓度低于 5 mM 时，Hb 的四个血红素均与氧气结合；当 NaDT 浓度增加到 20 mM 时，得到部分结合氧气的 Hb 结构；当 NaDT 浓度达到 60 mM 时，Hb 完全脱氧。这表明通过调整这些参数，可以有效控制样本的氧气暴露，维持 deoxyHb 的状态直至结构测定。
- （an）aerobic 条件下维氏固氮菌 MoFeP 的 cryoEM 结构：研究人员以维氏固氮菌的 MoFeP 为研究对象，探究（an）aerobic 冷冻协议对高度氧敏感样本的适用性。在传统有氧网格玻璃化过程中，未添加保护油层和 NaDT 的 MoFeP 样本，其 P - 簇被氧化为P2+状态。而在使用（an）aerobic chameleon 协议，添加保护油层和 60 mM NaDT 的条件下，MoFeP 的 FeMoco 和 P - 簇均保持完整，P - 簇处于完全还原的PN状态。进一步研究发现，即使 NaDT 浓度降低至 20 mM 或 5 mM，MoFeP 的金属簇仍能保持还原状态。这表明该方法适用于制备功能厌氧的 cryoEM 网格，获取氧敏感蛋白的高分辨率结构。
研究结论表明，（an）aerobic 工作流程能够有效解决氧敏感蛋白的 cryoEM 样本制备难题，为研究人员提供了一种可靠的方法来获取高分辨率的蛋白结构。这一研究成果不仅有助于深入理解金属蛋白等氧敏感蛋白在生物过程中的作用机制，还为相关疾病的研究和治疗提供了潜在的结构基础。此外，该工作流程仅需对现有的广泛使用的 EM 网格冷冻方法进行少量修改，具有广泛的应用前景，有望推动结构生物学领域在氧敏感蛋白研究方面取得更多突破。
