植物与细菌间的跨界 RNAi：细胞外小 RNA 调控细菌基因沉默的新机制

为探究植物细胞外 RNA 能否调控植物相关细菌的基因表达，研究人员以拟南芥（Arabidopsis thaliana）和番茄致病变种丁香假单胞菌（Pseudomonas syringae pv. tomato strain DC3000，Pto DC3000）为模型进行研究。结果发现植物表达的 sRNAs 可抑制 Pto DC3000 的致病性，还鉴定出不同形式的细胞外 sRNAs。该研究揭示了抗菌基因沉默（AGS）现象，有助于理解植物与微生物的相互作用。

　　在奇妙的植物微观世界里，植物与微生物之间的互动一直是科学家们热衷探索的领域。RNA 干扰（RNAi）作为一种保守的基因调控机制，在植物抵御病毒、细菌、真菌等病原体的过程中发挥着重要作用。植物小 RNA（sRNAs）不仅能在植物细胞间移动，还可与非病毒的真核生物进行跨界交流，比如植物 sRNAs 能进入真菌病原体中沉默其致病因子，真菌和卵菌的 sRNAs 也能进入植物细胞影响植物防御。然而，植物 sRNAs 能否进入与之相互作用的细菌并调节细菌基因表达，一直是个未解之谜。同时，之前的研究表明，在真核生物中有效的宿主诱导基因沉默（HIGS）和喷雾诱导基因沉默（SIGS）技术，在细菌中是否同样有效也不清楚。为了解开这些谜团，来自法国的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员选用革兰氏阴性致病细菌 Pto DC3000 和植物拟南芥作为研究模型。在技术方法上，主要运用了以下几种关键技术：首先是基因工程技术，构建多种转基因拟南芥植株，使其表达针对 Pto DC3000 毒力因子的 sRNAs；其次是生物学检测技术，通过气孔开放实验、细菌浸染实验等检测细菌的致病性变化；还有分子生物学技术，包括 RNA 提取、Northern blot 分析、sRNA 测序等，用于分析 RNA 的表达和功能；此外，借助电子显微镜技术观察细胞外囊泡（EVs）的形态和结构。

研究结果如下：

1. 稳定表达抗 cfa6/hrpL sRNAs 降低 Pto DC3000 毒力：Pto DC3000 感染拟南芥时，会通过分泌冠菌素（COR）重新打开气孔进入叶组织。研究人员构建了表达抗 cfa6 和抗 hrpL sRNAs 的拟南芥转基因株系。实验表明，这些转基因株系对 Pto DC3000 诱导的气孔开放不敏感，且 Pto DC3000 在这些株系中的定殖能力下降，说明表达抗 cfa6/hrpL sRNAs 可降低 Pto DC3000 的毒力。
2. 抗菌 sRNAs 而非其 dsRNA 前体具有生物学活性：通过引入 dcl2 - 1、dcl3 - 1 和 dcl4 - 2 突变，研究发现长 HRPL 双链 RNA（dsRNAs）不太可能是抗毒作用的原因，而 sRNA 物种才是 AGS 的关键 RNA 实体。体外合成实验也证实，抗 cfa6/hrpL sRNAs 能抑制气孔开放，而其未加工的 dsRNA 前体则不能。
3. 不同定位的活性抗 cfa6/hrpL sRNAs：研究人员对与 PEN1 阳性 EVs 共纯化的质外体流体（APF）组分进行研究，发现其中的活性抗 cfa6/hrpL sRNAs 主要位于 EVs 外，且可能与蛋白质结合；而与 TET8 阳性 EVs 共纯化的 APF 组分中的活性抗 cfa6/hrpL sRNAs 则位于 EVs 内；在不含典型 EVs 的 APF 组分中，也存在活性抗 cfa6/hrpL sRNAs，它们可能未与蛋白质结合，以游离形式存在，研究人员将其命名为细胞外游离 sRNAs（efsRNAs）。
4. 抗 cfa6/hrpL efsRNA 双链体的功能及摄取：从 APF 的 SN 组分中纯化出的抗 cfa6/hrpL efsRNA 双链体具有生物学活性，能抑制 Pto DC3000 诱导的气孔开放。并且，部分 SN 衍生的抗 hrpL sRNAs，包括一种功能性的 21 nt sRNA，可被 Pto DC3000 细胞内化。
5. 水杨酸（SA）增强抗菌基因沉默效果：研究发现，SA 处理 IR - CFA6/HRPL 植物可触发 Pto DC3000 细胞中 HrpL 的沉默。SA 预处理的 IR - CFA6/HRPL#4 植物叶段能显著降低 Pto DC3000 中 HrpL 蛋白的积累，说明 SA 能增强 HIGS 的功效。
6. 内源性 sRNAs 的作用：Pto DC3000 可摄取拟南芥内源性 sRNAs，这些 sRNAs 来自多种基因组起源，包括 tRNA 衍生片段（tRFs）等。部分内源性 sRNAs 在 Pto DC3000 中具有预测的靶标，且 SA 的生物合成和 / 或信号传导可下调这些靶标的表达，表明内源性植物 sRNAs 可能在感染过程中直接重编程细菌基因表达。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了拟南芥编码的抗 cfa6/hrpL sRNAs 可从植物细胞外化，抑制 Pto DC3000 的致病性，且抗 cfa6/hrpL sRNA 双链体是具有生物学活性的关键分子，这与真核生物中的环境 RNAi 存在差异。研究还发现了不同定位的活性 sRNAs，为理解植物与细菌间的相互作用提供了新视角。此外，SA 处理可增强 HIGS 效果，内源性 sRNAs 也参与了对细菌基因表达的调控。这些发现对于深入理解植物如何调节微生物转录组、微生物群落组成以及相关细菌的基因组进化具有重要意义，也为开发基于 RNA 的植物病害生物防治策略提供了理论依据。