微泡携 EV71 病毒穿越血脑屏障致脑损伤机制新探：为病毒脑炎治疗开辟新径

《Cell Communication and Signaling》：Microvesicles carrying EV71 virions cross BBB through endocytic pathway to induce brain injury

为探究肠道病毒 71 型（EV71）引发神经系统并发症的机制，研究人员开展了微泡（MVs）是否介导 EV71 穿越血脑屏障（BBB）的研究。结果发现 MVs 可携带 EV71 病毒穿越 BBB，受损线粒体促进该过程并加重脑损伤，这为治疗病毒性脑炎提供了新靶点。

　　在儿童手足口病的众多致病因素中，肠道病毒 71 型（EV71）是主要 “元凶” 之一。它不仅会引发手足口病，严重时还会导致诸如脑炎、神经源性肺水肿等神经系统并发症，甚至夺走患儿生命。然而，EV71 究竟是如何突破血脑屏障（BBB），进而引发这些严重的神经系统问题的，一直是医学领域的未解之谜。血脑屏障如同人体大脑的 “忠诚卫士”，严密地阻挡着病原体和免疫细胞进入中枢神经系统（CNS），可 EV71 却能突破防线，这背后的机制让科研人员困惑不已。同时，有研究表明微泡（MVs）在细胞间通讯中发挥着重要作用，还能携带各种 “货物”，并且有穿越血脑屏障的能力，那么 MVs 在 EV71 穿越血脑屏障的过程中是否扮演着关键角色呢？为了解开这些谜团，南京大学公共卫生研究中心等机构的研究人员展开了深入研究，相关成果发表在《Cell Communication and Signaling》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。通过细胞培养获取不同细胞系，如 HeLa 细胞、U251 细胞和人脑血管内皮细胞（hCMEC/D3） ，并对其进行相应处理。利用差速离心法分离微泡，借助 Western blot 分析、免疫荧光测定、qPCR 等技术检测相关蛋白、基因表达以及病毒感染情况。构建体外血脑屏障模型和进行体内成像实验，观察微泡穿越血脑屏障的能力 。

研究结果如下：

1. 微泡的特征及携带病毒情况：通过差速离心法从感染 EV71 的 HeLa 细胞培养上清中分离出微泡，其大小在 100nm - 1μm 之间，呈异质性，感染 EV71 的 HeLa 细胞分泌的微泡数量明显增加。经检测，这些微泡中含有 EV71 RNA 和蛋白，包括 VP1 和 2C，并且通过多种实验证实微泡中存在 EV71 病毒颗粒。
2. 微泡感染细胞效率更高：免疫荧光实验表明，MVsMock 和 MVsEV71 都能进入 HeLa 细胞和 hCMEC/D3 细胞。对比 MVsEV71 和游离 EV71 对 HeLa 细胞和 hCMEC/D3 细胞的感染效率，发现 MVsEV71 感染后病毒 RNA 更早检测到，且复制水平更高，在缺乏 EV71 主要受体 SCARB2 的 L929 细胞中，MVsEV71 也能有效感染，而游离 EV71 几乎无法感染，说明 MVs 能以受体非依赖方式更高效地传递病毒。
3. 微泡穿越血脑屏障效率更高：在体外，利用 hCMEC/D3 细胞构建血脑屏障模型，发现 MVsEV71 可破坏血脑屏障完整性，增加其通透性，并且穿越血脑屏障的 MVsEV71 能进入下腔的 HeLa 细胞和 U251 细胞，且感染效率高于游离 EV71。在体内，给两周龄 AG6 小鼠腹腔注射 DiR 标记的 MVs，通过体内成像观察到 MVsEV71 能穿越血脑屏障，qPCR 检测发现注射 MVsEV71 的小鼠血液和脑组织中 EV71 RNA 富集量更高，HE 染色显示其脑损伤更严重，炎症因子 TNF-α 和 IL-6 水平升高。
4. 微泡破坏血脑屏障机制：MVsEV71 可降低 hCMEC/D3 细胞中紧密连接蛋白 ZO-1 和 occludin 的表达，破坏紧密连接，同时通过 Annexin V/PI 双染色等实验证明其能诱导 hCMEC/D3 细胞凋亡，增加 cleaved-Caspase 3 蛋白水平和 Bax mRNA 水平。
5. 微泡穿越血脑屏障的途径：研究发现 MVsEV71 通过非网格蛋白依赖的内吞途径穿越血脑屏障，使用不同的内吞抑制剂处理细胞，发现氯丙嗪（clathrin 抑制剂）不影响 MVsEV71 的内化，而 genistein（参与小窝介导的内吞作用的酪氨酸激酶抑制剂）和 dynasore（dynamin 介导的内吞途径抑制剂）能显著抑制其内化。此外，部分内化的 MVs 会进入溶酶体进行降解。
6. 受损线粒体的作用：EV71 感染会促进受损线粒体包裹在微泡中，从感染细胞中分离的微泡含有线粒体相关蛋白 COX IV，且线粒体结构受损，ROS 水平升高。体外实验表明，受损线粒体可促进 MVsEV71 穿越血脑屏障，增加病毒在脑内的复制，并诱导细胞凋亡。
7. 微泡诱导脑损伤的机制：MVsEV71 感染 U251 细胞后，通过流式细胞术、Western blot 等实验发现，细胞内 ROS 水平升高，线粒体蛋白 VDAC1 和 COX IV 水平降低，线粒体膜电位下降，同时 NOX4 介导的 ROS 通路被激活。使用 NOX4 特异性抑制剂 GLX351322 处理细胞，可抑制 MVsEV71 引起的细胞病变效应（CPE）和 VP1 表达。

研究结论和讨论部分指出，本研究揭示了 MVs 携带 EV71 病毒穿越血脑屏障并诱导脑损伤的新机制，受损线粒体在这一过程中起到了促进作用。这一发现加深了人们对 EV71 感染中枢神经系统机制的理解，为治疗病毒性脑炎提供了新的潜在靶点，具有重要的理论和临床意义。但目前对于 MVs 携带的货物分子如何具体导致血脑屏障紧密连接的破坏，以及受损线粒体中哪些成分在穿越血脑屏障过程中发挥关键作用等问题，仍有待进一步研究探索。