基于伪狂犬病病毒 Bartha 株的 Cre 依赖型逆行跨多突触示踪剂的开发：为神经科学研究开辟新途径

《Molecular Brain》：Development of Cre-dependent retrograde trans-multisynaptic tracer based on pseudorabies virus bartha strain

为解决特定神经元亚群神经回路多级输入映射的问题，研究人员开展了基于伪狂犬病病毒（PRV）Bartha 株开发 Cre 依赖型逆行跨多突触示踪剂的研究。结果成功制备 PRV676 和 PRV829，可用于描绘表达 Cre 的神经元亚群的多级输入，为神经科学研究提供了新工具。

　　在神经科学领域，大脑的神经回路如同一个神秘而复杂的迷宫，每一条 “道路” 都隐藏着大脑运作的奥秘。为了深入了解大脑的工作机制，绘制特定神经元亚群的神经回路至关重要。目前，虽然已有多种表达 Cre 重组酶（Cre recombinase）的转基因小鼠被广泛应用于神经科学研究，但用于映射特定神经元亚群神经回路多级输入的 Cre 依赖型跨多突触示踪剂却十分有限。现有的 Cre 依赖型跨多突触示踪剂存在高细胞毒性、荧光表达水平低等缺陷，无法满足科研需求，因此开发更优良的示踪剂迫在眉睫。

中国科学院深圳先进技术研究院的研究人员针对这一问题展开研究。他们以伪狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）Bartha 株为基础，通过基因工程手段，开发出两种新的示踪剂 PRV676 和 PRV829。这一研究成果发表在《Molecular Brain》上，为神经科学研究带来了新的曙光。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过构建多种质粒进行同源重组制备重组病毒；其次，采用立体定位显微注射技术将示踪剂注射到小鼠大脑特定区域；最后，利用免疫组织化学技术对大脑切片进行染色和成像分析 。

研究结果如下：

1. Cre 依赖型 PRV 示踪剂的制备：研究人员通过同源重组，用 Cre 依赖的荧光蛋白基因和 TK 基因表达盒替换 PRV Bartha 株的 TK 基因，成功制备了 PRV676 和 PRV829。这两种示踪剂在体外能够表达蓝色荧光蛋白，产生相似大小的噬菌斑，并且在有 Cre 存在的情况下，能分别表达增强型绿色荧光蛋白（EGFP）和红色荧光蛋白（mRuby3），且荧光信号密度随时间增加12。
2. 示踪剂在体内的 Cre 依赖表达和病毒子代产生：将 PRV676 和 PRV829 分别注射到 C57BL/6J 小鼠和 DAT-Cre 小鼠的腹侧被盖区（ventral tegmental area，VTA）。结果显示，在 C57BL/6J 小鼠大脑注射部位未观察到 EGFP 和 mRuby3，而在 DAT-Cre 小鼠大脑注射部位则能观察到，且 C57BL/6J 小鼠在实验期间存活，DAT-Cre 小鼠在感染后 6 天死亡。这表明两种示踪剂在体内严格依赖 Cre 表达荧光蛋白并产生病毒子代34。
3. 示踪剂映射特定神经元多级输入神经回路的能力：将 PRV676 注射到 DAT-Cre 小鼠的 VTA 区域，在多个脑区观察到 EGFP 阳性神经元；将 PRV829 注射到 vGat-Cre 小鼠的背外侧纹状体（dorsolateral striatum，DLS）区域，在多个脑区发现 mRuby3 阳性神经元。这证明 PRV676 和 PRV829 可用于描绘表达 Cre 的特定神经元亚群的多级输入56。

研究结论和讨论部分指出，本研究成功构建了两种新的逆行跨多突触示踪剂 PRV676 和 PRV829，为神经科学研究提供了有力工具。不过，与其他示踪剂一样，这两种示踪剂也存在细胞毒性较高的问题，未来研究应致力于降低其细胞毒性。此外，PRV 和狂犬病病毒（Rabies virus，RV）在标记神经回路方面各有特点，二者都对描绘神经回路具有重要意义。这两种新示踪剂的出现，为神经科学研究打开了新的大门，有助于科研人员更深入地探索大脑神经回路的奥秘，对理解大脑的工作机制、研究相关神经系统疾病等方面具有重要的推动作用。