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本文聚焦胶质母细胞瘤（GBM），发现 EGFRvIII 突变可通过表观遗传上调 RAD51AP1，其与 RAD51、UAF1 形成复合物促进 DNA 损伤修复，导致替莫唑胺（TMZ）耐药。该研究为 GBM 靶向治疗提供新思路，对提升患者预后意义重大。
### 研究背景
胶质母细胞瘤（GBM）是恶性程度最高的原发性颅内肿瘤，患者预后差，即便经过手术及放化疗，中位生存期也仅 15 个月。替莫唑胺（TMZ）作为一线化疗药物，其耐药问题严重限制患者预后，而 DNA 损伤修复是导致耐药的关键因素之一。EGFRvIII 重排突变在 GBM 中常见，占比 20 - 30%，会激活下游信号通路，促使肿瘤细胞恶性生长，携带该突变的患者预后更差。目前虽有针对 EGFRvIII 的药物临床试验，但 EGFRvIII 导致化疗耐药的机制仍有待深入研究。
研究方法
- 样本及细胞处理：临床样本收集经北京天坛医院伦理委员会批准，患者签署知情同意书；动物实验获相关伦理委员会批准。GBM 细胞系购自中国科学院生物化学与细胞生物学研究所等，部分为患者来源细胞系。用含 RAD51AP1 和 EGFRvIII 信使 RNA（mRNA）片段的慢病毒转染细胞。
- 实验试剂：TMZ、TTK21 等多种化学试剂购自相应公司，用于细胞处理。
- 数据收集：从 CGGA 和 TCGA 数据库获取 GBM 患者转录组测序数据及临床信息；部分 RNA 测序（RNA - seq）数据来自前期研究或公共数据库。
- 实验方法：运用 RNA 测序分析筛选差异表达基因（DEGs），进行基因本体（GO）分析；通过 CRISPR - Cas9 文库筛选关键基因；采用单细胞 RNA 测序分析细胞特异性基因；借助多种实验，如细胞活力测定（CCK8 法）、Transwell 侵袭实验、彗星实验、免疫荧光（IF）染色等，探究基因功能；还进行免疫印迹、免疫共沉淀（Co - IP）、集落形成实验、免疫组化染色、Annexin V/PI 染色、染色质免疫沉淀聚合酶链反应（ChIP - PCR）及动物实验等，并运用相应统计方法分析数据。
研究结果
- 关键基因的确定：对比 EGFR 突变和野生型 GBM 患者数据，筛选出多个 DEGs，功能涉及凋亡、血管生成等。对 EGFRvIII 突变和野生型 U87MG 细胞进行 RNA - seq 分析，也发现大量 DEGs，富集于组蛋白修饰等。通过 CRISPR - Cas9 文库筛选和单细胞转录组分析，确定 RAD51AP1 为 EGFRvIII 突变 GBM 中的关键共致死基因。
- EGFRvIII 对 RAD51AP1 表达的调控：EGFRvIII 突变 GBM 细胞中 RAD51AP1 表达高于野生型细胞。研究发现，组蛋白 H3K27 乙酰化（H3K27ac）在 RAD51AP1 启动子区域高度富集，且 EGFRvIII 突变细胞中 H3K27ac 和 SOX9 在该区域的结合更强。抑制 P300（H3K27 赖氨酸特异性乙酰转移酶）和 SOX9，可降低 RAD51AP1 表达；激活 P300 则提升其表达，表明 EGFRvIII 突变通过 H3K27ac 调控 SOX9，进而促进 RAD51AP1 过表达。
- RAD51AP1 对 GBM 恶性表型及 TMZ 耐药的影响：在 EGFRvIII GBM 细胞中敲低 RAD51AP1，降低了 TMZ 的半数抑制浓度（IC50），抑制细胞增殖、迁移和侵袭能力，增强 TMZ 对细胞的抑制作用；过表达 RAD51AP1 则促进肿瘤细胞增殖和侵袭，降低 TMZ 抑制效果，说明过量的 RAD51AP1 增强了 GBM 细胞的恶性行为。
- RAD51AP1 促进 TMZ 耐药的机制：实验表明，高表达 RAD51AP1 的细胞对 TMZ 更具抗性，敲低 RAD51AP1 可增加 TMZ 诱导的 DNA 断裂、γ - H2AX 焦点和细胞凋亡，而过表达则可防止 DNA 损伤，说明 RAD51AP1 通过促进 DNA 损伤修复促进 TMZ 耐药。进一步研究发现，RAD51AP1 可与 RAD51、UAF1 形成复合物，EGFRvIII GBM 细胞经 TMZ 处理后，沉淀出更多该复合物相关蛋白，敲低 RAD51AP1 则减少复合物形成，证实 RAD51AP1 通过与 RAD51、UAF1 结合促进 DNA 损伤修复。
- 动物模型验证：构建 EGFRvIII 突变的原位动物模型，敲低 RAD51AP1 显著抑制肿瘤生长，增强 TMZ 对肿瘤体积的抑制作用，延长小鼠生存期，同时增加 TMZ 诱导的 γ - H2AX 焦点，抑制 Ki - 67 表达，减少 RAD51 - UAF1 复合物形成，表明干扰 RAD51AP1 可提高 EGFRvIII 异种移植模型对 TMZ 的敏感性。
研究讨论
EGFRvIII 突变在 GBM 中常见，介导的 DNA 损伤修复是 TMZ 耐药的主要机制。此前虽发现 RAD51AP1 与 DNA 损伤修复和耐药相关，但它与 EGFRvIII 的调控关系尚不明确。本研究整合多组学数据和实验方法，揭示了 EGFRvIII 通过 H3K27ac 促进 SOX9 与 RAD51AP1 启动子结合，上调其表达，进而形成 RAD51AP1 - RAD51 - UAF1 复合物介导 DNA 损伤修复，导致 TMZ 耐药。不过，研究存在一定局限性，如未构建敲除 RAD51AP1 或 SOX9 的细胞系。总体而言，该研究为 EGFRvIII 突变 GBM 患者的靶向治疗提供了新策略和理论依据。
