FLT3 配体调控肠道相关淋巴组织来源的调节性树突状细胞诱导调节性 T 细胞扩增的机制及在溃疡性结肠炎治疗中的潜在意义

本文聚焦肠道相关淋巴组织（GALTs）中的树突状细胞（DCs）。研究发现调节性树突状细胞（DCregs）可促进调节性 T 细胞（Tregs）增殖，Fms 样酪氨酸激酶 3 配体（FLT3L）通过 Notch 通路增强这一过程。该研究为溃疡性结肠炎（UC）治疗提供新思路，值得关注。

　　### 引言
树突状细胞（DCs）作为肠道相关淋巴组织（GALTs）中的关键抗原呈递细胞，其增殖和分化受 Fms 样酪氨酸激酶 3 配体（FLT3L）及其受体 FLT3 的调控。GALTs 中的 DCs 可分化为不同亚群，其中调节性树突状细胞（DCregs）能促进免疫耐受，在溃疡性结肠炎（UC）中发挥保护作用。此前研究发现，UC 小鼠结肠组织中 FLT3L 表达、CD103? DCs 和 Tregs 数量减少，FLT3L 治疗可缓解炎症并增加相关细胞数量。但 FLT3/FLT3L 通路对 Tregs 扩增的影响机制尚不清楚，且 DCregs 促进 Tregs 增殖的具体机制也有待明确。同时，Jagged1（JAG1）/Notch 信号通路在调节 Tregs 扩增和免疫耐受中起关键作用，FLT3/FLT3L 还可能通过激活 Rac1 影响细胞迁移，本研究旨在探究 DCreg 诱导 Treg 扩增的机制以及 FLT3L 在此过程中的作用。

方法

1. 实验动物：选用 6 - 8 周龄、体重 25g 的无特定病原体（SPF）雄性 BALB/c 小鼠，饲养于大连医科大学动物研究实验室，实验遵循相关动物实验规范并获批准。
2. 建立小鼠结肠炎模型：将小鼠分为对照组、DSS 诱导的结肠炎模型组（DSS 组）、DSS 诱导的结肠炎 + DCregs 腹腔注射组（DSS + DCreg 组）、DSS 诱导的结肠炎 + DCregs 和 FLT3L 腹腔注射组（DSS + DCreg + FLT3L 组）。除对照组外，其他组小鼠饮用含 5% DSS 的水 7 天诱导急性 UC，同时分别腹腔注射 DCregs、DCregs 联合 FLT3L 或磷酸盐缓冲液（PBS），记录疾病活动指数（DAI），实验结束后处死小鼠进行相关检测。
3. 结肠炎的宏观和组织学评估：解剖小鼠结肠，根据结肠宏观损伤指数（CMDI）评估肠道黏膜损伤程度；对结肠组织进行固定、切片和苏木精 - 伊红（HE）染色，进行组织病理学评分。
4. RNA 提取和定量实时聚合酶链反应（RT - qPCR）：从 DCregs 和 Foxp3? Tregs 中提取总 RNA，逆转录为互补 DNA（cDNA）后进行 RT - qPCR 分析，检测 JAG1、Notch1 等基因的相对表达量。
5. 蛋白质提取和蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析：裂解细胞提取蛋白质，进行定量后经十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）分离，转膜后用相关抗体进行检测，用 Image J 软件分析条带强度。
6. 从 GALTs 中分离和纯化 DCs：分别制备肠系膜淋巴结（MLNs）、派尔集合淋巴结（PPs）和结肠固有层（LP）的淋巴细胞单细胞悬液，通过磁珠分选和流式细胞术（FC）进一步分离 CD11c?细胞及不同 DC 亚群。
7. 分离脾细胞中的 CD4? T 细胞和 CD4?CD25? T 细胞：取小鼠脾脏制备单细胞悬液，经离心分层获取淋巴细胞，再利用相关试剂盒和仪器分离 CD4? T 细胞和 CD4?CD25? T 细胞。
8. T 细胞抑制试验和混合淋巴细胞反应（MLR）：制备同种异体 BALB/c 脾细胞的 CD4? T 细胞，与不同亚群的 DCs 共培养 96h，用 MTT 法检测 CD4? T 细胞的增殖活性。
9. 细胞培养和迁移分析：将 DCregs 与前体 T 细胞共培养，检测不同条件下 CD25?Foxp3? T 细胞和 CD4? T 细胞的比例；通过直接接触和间接接触共培养 DCregs 与 CD4?CD25? T 细胞，分析相关指标；利用 Transwell 小室进行细胞迁移实验，检测 DCregs 的迁移能力。
10. FC 分析：使用荧光标记的抗体对细胞进行染色，通过 FC 检测细胞表面和细胞内分子的表达。
11. 统计分析：使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，数据以均值 ± 标准误表示，采用 t 检验或单因素方差分析（ANOVA）进行组间比较，P < 0.05 为差异有统计学意义。

结果

1. 从 GALTs 中分离和鉴定 DCregs：成功从小鼠 GALTs 中分离出 4 种 DC 亚群，MLR 实验显示 CD103?CD11b? DCs 免疫抑制能力最强，将其确定为 DCreg 亚群进一步研究。
2. FLT3L 和 DCregs 在前体 T 细胞分化为 Foxp3 表达的 Tregs 中的作用：DCregs 与 CD4?CD25? T 细胞共培养可增加 CD25?Foxp3? T 细胞的比例，添加 FLT3L 后该比例进一步升高。
3. FLT3/FLT3L 通路和 Rho 信号通路在 DCregs 迁移中的作用：FLT3L 可增强 DCregs 的迁移能力，Rac 抑制剂 NSC - 23766 能抑制其迁移，且在 DCregs 与 CD4?CD25? T 细胞共培养实验中，NSC - 23766 可降低 CD25?Foxp3? T 细胞的比例。
4. Notch 信号通路在 Treg 扩增中的作用：使用 γ - 分泌酶抑制剂 DAPT 抑制 Notch 通路后，DCregs/CD4? T 细胞共培养体系中 CD25?Foxp3? T 细胞的比例显著降低。
5. FLT3/FLT3L 通路通过直接接触促进 DCregs 诱导 Treg 扩增的作用：在 DCregs 与 CD4?CD25? T 细胞直接接触的共培养体系中，FLT3L 可促进 Treg 扩增，沉默 FLT3 或添加 DAPT 会抑制这一过程，同时 FLT3L 可上调 JAG1 和 Notch1 的表达，二者表达与 Tregs 扩增相关。
6. DAI 评分分析：DSS 组 DAI 评分显著高于对照组，DSS + DCreg + FLT3L 组和 DSS + DCreg 组的 DAI 评分从实验第 3 天和第 4 天起显著低于 DSS 组，且 DSS + DCreg + FLT3L 组在实验后期 DAI 评分低于 DSS + DCreg 组。
7. CMDI、组织病理学评分和结肠中 FLT3 的表达：DSS + DCreg 组和 DSS + DCreg + FLT3L 组的 CMDI 评分和组织病理学评分均低于 DSS 组，DSS 组结肠组织中 FLT3 表达降低，DSS + DCreg + FLT3L 组 FLT3 表达显著上调。
8. FC 分析 DCreg 和 Foxp3?Treg 的比例：DSS 组结肠 LP 和 MLN 中 DCregs 的比例显著降低，CD4? T 细胞比例升高；DSS + DCreg 组和 DSS + DCreg + FLT3L 组 DCregs 比例增加，CD4? T 细胞比例降低，且 Foxp3? Tregs 比例随着 DCregs 比例增加而升高。

讨论

DCs 在免疫反应和胃肠道免疫平衡中起重要作用，UC 患者结肠组织和淋巴结中 CD103? DCs 减少。本研究从 GALTs 中分离出多种 DC 亚群，确定 CD103?CD11b? DCs 为 DCregs，其在体内可缓解结肠炎并促进 Foxp3? Tregs 扩增，维持肠道免疫耐受。
FLT3L 对 DCreg 的增殖至关重要，在 DSS 诱导的结肠炎小鼠中，补充 FLT3L 可增加 DCregs 数量。FLT3/FLT3L 不仅影响 DC 发育，还对 DCregs 促进 Foxp3? Tregs 扩增的功能有重要作用，缺乏 FLT3L 或沉默 FLT3 会抑制 Tregs 扩增。
Rac 在 DC 迁移中不可或缺，FLT3/FLT3L 可通过 Rho 信号通路增强 DCregs 的迁移能力，Rac 抑制剂 NSC - 23766 抑制 DCregs 迁移，进而间接抑制 Treg 扩增。
Notch 信号通路影响 Treg 分化和免疫耐受，本研究发现抑制该通路会削弱 DCregs 扩增 Tregs 的能力，FLT3/FLT3L 通路可能通过 Rho 通路增强 DCreg 向 Tregs 的迁移，并上调 JAG1 表达，从而通过 Notch 通路促进 Tregs 扩增。
本研究揭示了 FLT3/FLT3L 通路在 DCregs 诱导 Tregs 扩增中的重要作用，但存在一定局限性，如仅使用 BALB/c 小鼠模型，后续需进一步验证。不过，这些发现仍为 UC 的治疗提供了新的潜在方向 。