氨基酸残基决定阪崎克罗诺杆菌噬菌体宿主特异性：解锁噬菌体精准防控新密码

本文聚焦阪崎克罗诺杆菌（Cronobactersakazakii）噬菌体，从污水中分离出 CRES7 和 CRES9 两种噬菌体。研究发现，其尾纤维基因两个核苷酸差异导致氨基酸变化，影响宿主范围、吸附率和裂解量。该成果为噬菌体生物防控策略开发提供关键依据。

　　

引言

阪崎克罗诺杆菌（Cronobactersakazakii）是一种革兰氏阴性机会性食源性病原体，广泛存在于环境中，常污染各类食品，对新生儿、老年人和免疫功能低下者危害极大，可引发严重感染，死亡率高达 80%。传统抗生素治疗因细菌耐药性问题受限，噬菌体作为新兴生物防治剂，能特异性裂解细菌细胞，在治疗和食品安全领域前景广阔。

噬菌体感染细菌始于尾纤维识别宿主受体，受体结合蛋白（RBPs）的微小突变会显著影响对细菌表面受体的识别，进而改变噬菌体的感染性和宿主谱。脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌的重要毒力因子，也是噬菌体常见受体，由脂质 A、核心区域和 O 抗原组成。阪崎克罗诺杆菌有多种 O 抗原血清型，其高度变异性可能阻碍噬菌体生物防治策略的有效性。因此，深入了解阪崎克罗诺杆菌噬菌体与宿主的分子相互作用机制至关重要。

结果

1. CRES7 和 CRES9 的分离与形态：从韩国污水处理厂的污水样本中，以阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544 为宿主菌株，分离出 CRES7 和 CRES9 两种噬菌体。透射电子显微镜（TEM）分析显示，它们均为典型的长尾噬菌体科形态，头部呈二十面体，大小分别为 78.2±3.1nm（CRES7）和 75.5±1.6nm（CRES9），非收缩性尾部长度分别为 167.9±4.3nm（CRES7）和 171.0±3.5nm（CRES9）。CRES7 形成的噬菌斑（1.7±0.1mm）小于 CRES9（2.8±0.1mm）。
2. CRES7 和 CRES9 的基因组差异：CRES7 和 CRES9 的基因组均为环状双链 DNA，长度均为 49,065bp，GC 含量为 50.04%。在 78 个预测的开放阅读框（ORFs）中，61 个编码假设蛋白，其余 ORFs 涉及噬菌体包装、结构、DNA 复制、宿主裂解等功能。系统发育分析表明，它们属于 Drexlerviridae 家族，与 Cronobacter 噬菌体 CS01 在氨基酸水平上密切相关，且未发现与 tRNA、溶原转换、毒力因子或抗生素抗性相关的基因。两种噬菌体 DNA 同源性极高，仅在编码假定尾纤维的基因 28 中存在两个核苷酸差异，导致尾纤维蛋白（gp28）的 400 和 550 位氨基酸发生变化，CRES7 为 K400 和 S550，CRES9 为 N400 和 R550。
3. Gp28 与受体结合的关系：通过 PhageRBP 检测工具预测，Gp28 可能作为 RBP 发挥作用。保守结构域分析发现，gp28 包含尾纤维蛋白三聚化区域（InterProScan 编号：IPR048388）和分子内伴侣自加工（ICA）结构域（InterProScan 编号：IPR030392），这在多种噬菌体尾纤维中常见。AlphaFold2 预测 gp28 形成三聚体延伸结构，400 和 550 位氨基酸位于 C 末端 α - 螺旋重复序列的表面，可能影响受体结合，进而导致两种噬菌体宿主范围不同。
4. 宿主受体与宿主范围：通过斑点试验，发现仅缺失 O 抗原的 waaL 缺失突变体对 CRES7 和 CRES9 均具有抗性，补充 waaL 突变可恢复噬菌体敏感性，且 LPS 单独就能触发两种噬菌体的 DNA 释放，表明它们都以 O 抗原为宿主受体。对 24 株阪崎克罗诺杆菌的宿主范围测试显示，CRES9 能感染 19 株（79%），CRES7 仅能感染 11 株（46%），且它们对其他属细菌无感染性，证明了其对阪崎克罗诺杆菌的特异性。
5. 对不同 O 血清型的感染差异：对 9 株对 CRES7 和 CRES9 敏感性不同的阪崎克罗诺杆菌进行 PCR - 基于的 O 血清型分析，结果分为 O1、O3 和 O2 三种血清型。对两种噬菌体都敏感的菌株为 O1 血清型，仅对 CRES9 敏感的为 O3 血清型，对两种噬菌体都耐药的为 O2 血清型。分析 LPS 轮廓发现，O1 血清型中部分菌株 O 抗原链长度相似，CRES7 和 CRES9 对其感染效率相似，但 15 - 1 菌株 O 抗原链较长，CRES9 对其感染效率更高；O3 血清型菌株 O 抗原链比 O1 血清型更长，且仅对 CRES9 敏感；O2 血清型菌株 31 - 2 的 O 抗原链长度介于 O1 和 O3 之间，对两种噬菌体均耐药。这表明 gp28 的 400 和 550 位氨基酸能识别和区分 O 抗原结构，即使在同一血清型内也存在差异。
6. 吸附率和裂解量差异：在阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544 上，CRES7 的吸附率高于 CRES9，感染 8 分钟内，93% 的 CRES7 吸附到宿主细胞，而 CRES9 为 83%，且 CRES7 的吸附常数（k）比 CRES9 高 162%。两种噬菌体对 O3 菌株的吸附效率均降低，CRES9 吸附更有效，CRES7 对 O3 菌株的吸附未导致有效感染；对 O2 菌株，两种噬菌体在 90 分钟内均未检测到吸附。一步生长曲线显示，CRES7 和 CRES9 的潜伏期约为 8 分钟，隐晦期约为 4 分钟，但 CRES7 的裂解量（57.6 PFU / 感染细胞）约为 CRES9（30.3 PFUs / 感染细胞）的两倍，表明尾纤维 gp28 的 400 和 550 位氨基酸差异影响吸附和裂解量。
7. 抗菌活性和稳定性：细菌挑战试验表明，在感染复数（MOI）为 0.1 时，CRES7 和 CRES9 均能在 1 小时内抑制阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544 的生长，并持续抑制 5 小时，且两者抑制模式无显著差异，说明 gp28 的变异不影响整体裂解活性。热稳定性试验显示，两种噬菌体在 60°C 以下保持活性，70°C 时失活；pH 稳定性试验表明，它们在 pH 3 - 11 范围内保持稳定，在极端 pH（pH 2 和 pH 12）下 1 小时内失活，即 gp28 变异不影响噬菌体的热稳定性和 pH 稳定性。

讨论

尾纤维在噬菌体识别和结合细菌受体过程中起关键作用，氨基酸替换可显著影响宿主识别和宿主范围。本研究中，CRES7 和 CRES9 尾纤维 gp28 的两个天然氨基酸变异，通过对 LPS O 抗原的差异结合影响宿主识别。CRES7 仅感染 O1 菌株，CRES9 能感染 O1 和 O3 菌株。O1 血清型在婴儿配方奶粉中常见且与临床感染相关，O3 血清型在食品加工环境中分离增加，因此像 CRES9 这样宿主范围更广的噬菌体在食品安全防控中更具优势。

Gp28 的 400 位氨基酸靠近多个芳香族氨基酸，可能在 O 抗原结合中起重要作用；550 位氨基酸位于 C 末端结构域远端，其氨基酸替换可能影响静电相互作用和与 O 抗原的结合亲和力，最终改变噬菌体宿主范围。例如，阪崎克罗诺杆菌 15 - 1 菌株虽为 O1 血清型，但 O 抗原结构独特，CRES7 和 CRES9 对其感染效率不同，表明 400 和 550 位氨基酸能识别同一血清型内的细微 O 抗原变异。

CRES7 的吸附速率高于 CRES9，可能与其形成较小噬菌斑有关；CRES7 的裂解量约为 CRES9 的两倍，虽两者潜伏期和隐晦期相似，但其他因素如翻译和噬菌体组装效率可能影响裂解量，尾纤维氨基酸差异可能影响 gp28 三聚体稳定性，进而影响病毒粒子组装。

CRES7 和 CRES9 从同一环境样本中分离，自然存在的尾纤维变异反映了自然选择压力对噬菌体 - 宿主相互作用的影响。CRES9 宿主范围广，更适应细菌多样性高的环境；CRES7 吸附快、子代产量高，在细菌种群密集、多样性低的环境中可能更具优势。研究这些自然氨基酸差异有助于理解噬菌体适应性，为噬菌体生物防治策略开发提供理论基础。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：以阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544 为宿主菌，在 37°C、摇床条件下于 LB 肉汤中培养。培养含质粒的细菌时，添加 50μg/mL 氨苄青霉素。
2. 噬菌体分离和储存液制备：采用过滤、富集、离心、过滤、平板划线等步骤从污水样本中分离噬菌体，经多次纯化获得单噬菌体分离株。通过感染指数生长期的宿主菌、离心、过滤收集噬菌体裂解液，再经 CsCl 梯度超速离心制备浓缩噬菌体储存液，储存于 4°C 玻璃小瓶中。
3. TEM 分析：将噬菌体样本（101? PFU）置于辉光放电的福尔马林 / 铜网格上，用 2% 醋酸铀（pH 4.0）染色，在能量过滤 TEM（LIBRA 120，Carl Zeiss，德国）下观察拍照，用 ImageJ 程序测量头部和尾部尺寸（n = 5）。
4. 噬菌体基因组 DNA 全基因组测序：用酚 - 氯仿法提取噬菌体基因组 DNA，通过 Illumina Miseq 测序，SPAdes version 3.15.2 组装。利用 GeneMarkS、RAST、BLASTp、InterProScan 数据库预测 ORFs 及其功能并手动注释，用 GeneScene version 0.99.8.0 可视化基因组图谱，通过 ViPTree 和 VICTOR 分析噬菌体蛋白质组系统发育。
5. Gp28 的计算机分析：用 BLASTp 鉴定 gp28 的功能和相关蛋白，Clustal X2 进行多序列比对，Jalview 软件可视化。用 PhageRBPdetection version 2 分析 RBP 可能性，InterProScan 和 HHpred 在线服务器分析保守结构域，AlphaFold2 version 2.1.2 预测 gp28 的同源三聚体结构，PyMOL 2.5.2 可视化结构。
6. 宿主受体测定：以阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544 及其突变株为对象，将噬菌体悬液点在细菌 lawn 上，37°C 孵育 6 小时后计算感染效率（EOP），同时进行互补研究。
7. 体外 DNA 释放试验：从阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544 中提取 LPS，将噬菌体（5×103 PFU/mL）与 LPS（50μg/mL）在 37°C 孵育 1 小时，通过噬菌斑试验定量剩余病毒粒子数，与未加 LPS 的对照组比较。
8. 宿主谱测定：选用 24 株阪崎克罗诺杆菌（包括 3 株标准菌株和 21 株韩国分离株）、6 株革兰氏阴性菌和 2 株革兰氏阳性菌，制备细菌 lawn，将噬菌体悬液点样并孵育，计算 EOP 以确定宿主谱。
9. O 血清型分析：采用 PCR 检测阪崎克罗诺杆菌菌株的 O 血清型，以特定引物对和 PCR 程序进行扩增，以阪崎克罗诺杆菌 ATCC 29544 和 ATCC 29004 分别作为 O1 和 O2 血清型的对照菌株。
10. LPS 提取和分析：用热酚 - 水法从过夜培养的阪崎克罗诺杆菌中提取 LPS，经沉淀、溶解后储存于 - 20°C。用脱氧胆酸盐 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（15% 丙烯酰胺凝胶）分析 LPS，用 Pro - Q Emerald 300 脂多糖凝胶染色试剂盒染色，GelDoc 仪器可视化。
11. 噬菌体吸附试验：指数生长期的细菌以 MOI 为 0.01 感染噬菌体，37°C 孵育 8 分钟，每隔 2 分钟取样、离心、过滤，稀释滤液后点样，计算吸附常数（k）。
12. 一步生长试验：指数生长期的阪崎克罗诺杆菌细胞以 MOI 为 0.01 感染噬菌体 4 分钟，离心洗涤后培养，每隔 4 分钟取两份样品，一份用 2%（wt/vol）氯仿处理，计算隐晦期、潜伏期和每感染细胞的 PFU。
13. 细菌挑战试验：指数生长期的阪崎克罗诺杆菌细胞以合适的 MOI 感染噬菌体，37°C 振荡培养 24 小时，每 30 分钟用 SpectraMax i3x 仪器测量 OD???，SM 缓冲液作为阴性对照。
14. 热稳定性和 pH 稳定性测试：将噬菌体悬液（10? PFU/mL）在不同温度（4°C、25°C、37°C、45°C、50°C、60°C、70°C）孵育 1 小时，在不同 pH（pH 2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12）的 SM 缓冲液中 37°C 孵育 1 小时，通过斑点试验计算噬菌斑数，确定热稳定性和 pH 稳定性。