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这篇文章聚焦戊型肝炎 D（HDV）诊断难题。研究基于 HDV 八基因型共通序列开发重组抗原（DTH10.1），以此构建酶联免疫吸附试验（ELISA）、免疫层析试验（ICT）及多重 ICT。这些检测方法对 HDV 各基因型检测灵敏度和特异性高，为 HDV 诊断提供了新方向。
戊型肝炎 D 病毒（HDV）概述
戊型肝炎 D 是由 HDV 引起的传染病，HDV 是一种卫星 RNA 病毒，依赖乙肝病毒（HBV）才能形成病毒包膜并进入肝细胞。全球约 1200 万人受 HDV 影响，不同地区患病率差异大，在部分 HBV 阳性患者中患病率可高达 50% 。HDV 分为 8 个基因型（HDV-1 至 HDV-8），感染可分为 HDV 超感染（慢性乙肝患者感染 HDV）和同时共感染。HDV/HBV 感染导致肝炎进展更快，患肝癌和肝硬化的风险更高，部分患者在感染后几年内就会出现肝硬化。
慢性乙肝感染以血浆中持续检测到 HBV 表面抗原（HBsAg）为特征，HBsAg 检测是乙肝筛查的重要手段，但检测灵敏度受病毒基因型、亚型及基因组重组影响，低水平 HBsAg 可能检测不到。对于 HBsAg 阳性患者，HDV 诊断依赖血清学和分子检测，但 HDV 感染常被漏诊。世界卫生组织（WHO）新指南建议对慢性乙肝患者进行普遍的 HDV 抗体检测，并采用两步双反射检测方案。
目前 HDV 诊断常用的酶联免疫吸附试验（ELISA）或化学发光免疫分析（CLIA）需要复杂实验室设施和专业人员操作，在中低收入国家难以普及。免疫层析试验（ICT）更适合现场检测，具有易运输、操作简便、结果快速等优点，但需要对所有 HDV 基因型都有高灵敏度。
材料与方法
- 人血清样本：样本分为三个面板。面板 1 用于测试原型开发，包含健康受试者、HBsAg 阳性者、HDV 阳性者等样本，部分样本用于交叉反应测试。面板 2 用于验证测试原型，随机选取，包含不同类型肝炎样本和健康供体样本。面板 3 来自法国国家戊型肝炎三角洲参考中心，包含多种肝炎样本，HDV 阳性样本进行了基因分型。
- 重组蛋白 DTH10.1 的表达与纯化：通过对 GenBank 数据库中覆盖 8 个 HDV 基因型的 47 个 HDAg 序列进行全长比对，生成共通序列，编码重组蛋白 DTH10.1。将其序列插入载体，转化大肠杆菌 BL21 (DE3) 细胞表达，用亲和层析纯化，并用多种方法进行分析鉴定。
- DTH10.1 ELISA：用 DTH10.1 抗原包被聚苯乙烯板，加入血清样本反应，通过一系列检测步骤，以吸光度判断结果。设置临界值，计算反应指数（RI）确定样本是否阳性。通过加速稳定性试验预测试剂盒保质期。
- ICT：将相关成分固定在膜上制备免疫层析试验条。用 DTH10.1-SUMO 开发检测抗 HDV IgG 的 ICT，优化蛋白与金纳米颗粒（AuNP）的结合。设计多重 ICT，同时检测抗 HDV IgG 和 HBsAg，评估其分析灵敏度。
- 统计分析：使用 GraphPad Prism 8.0 进行统计分析，计算灵敏度、特异性、准确性、受试者工作特征曲线（ROC）等指标，通过多种检验比较数据，用 kappa 指数评估测试间的一致性。
结果
- 工程化 DTH10.1 蛋白：比对得到的 DTH10.1 蛋白分子量约 19.9kDa，与 SUMO 标签融合后得到 DTH10.1-SUMO，分子量约 33kDa。两种蛋白均为可溶性表达，纯化后经 SDS-PAGE 和 Western blot 分析确认，LC-MS/MS 分析显示蛋白覆盖度良好。
- DTH10.1 ELISA：确定最佳包被蛋白量为 100ng / 孔，该 ELISA 对 189 个样本检测，灵敏度为 90.6%（95% CI：84.2% - 94.5%），特异性为 100.0%（95% CI：94.2% - 100.0%），准确性为 93.65%（95% CI：89.2% - 96.3%）。与商业试剂盒对比，部分样本结果存在差异。该 ELISA 对其他肝炎样本无交叉反应，加速稳定性试验表明试剂盒在冷藏条件下至少稳定 18 个月。
- 抗 HDV IgG 单免疫层析试验：用 DTH10.1-SUMO - AuNP 开发的 ICT，最初用 10μL 血清样本检测，灵敏度为 82.5%（95% CI：71.4% - 89.96%），特异性为 92.9%（95% CI：88.0% - 95.9%），准确性为 90.1%（95% CI：85.6% - 93.3%）。优化后的 ICT 用面板 2 样本检测，灵敏度提高到 91.3%（95% CI：85.0% - 95.1%），特异性为 99.3%（95% CI：95.2% - 99.96%），准确性为 95.4%（95% CI：92.1% - 97.4%）。
- 多重 ICT：抗 HDV IgG 和 HBsAg：多重 ICT 检测原理明确，不同感染情况样本在检测条上反应不同。最初用 10μL 样本检测，抗 HDV IgG 和 HBsAg 检测灵敏度分别为 84.1%（95% CI：73.2% - 91.1%）和 84.1%（95% CI：78.1% - 88.7%）。增加样本量到 50μL 后，抗 HDV IgG 灵敏度提高到 95.2%（95% CI：90.0% - 97.8%），HBsAg 检测灵敏度为 87.1%（95% CI：81.3% - 91.4%），特异性均较高。多重 ICT 对 HBsAg 分析灵敏度为 5IU/mL。
- ICT 对 8 种 HDV 基因型样本的评估：用面板 3 样本评估，ELISA、抗 HDV IgG ICT 和多重 ICT 对不同 HDV 基因型样本检测灵敏度均较高。ELISA 灵敏度为 98.7%（95% CI：93.0% - 99.9%），抗 HDV IgG ICT 灵敏度为 92.4%（95% CI：84.4% - 96.5%），多重 ICT（抗 HDV IgG 检测）灵敏度为 96.2%（95% CI：89.3% - 99.0%）。三种测试对 HDV RNA 阳性样本灵敏度均为 100%。同时，三种测试对其他病毒性和非病毒性肝炎样本存在一定交叉反应。
讨论
HDV 诊断存在不足，市场上缺乏批准的商业检测试剂盒。本研究开发的重组蛋白 DTH10.1 包含潜在 B 细胞表位和保守抗原决定簇，基于此构建的检测方法有重要意义。
DTH10.1 在 ELISA 中表现良好，但部分样本检测结果与商业试剂盒有差异，可能是检测时间不同导致抗体滴度变化或初始诊断错误。抗 HDV IgG ICT 最初灵敏度较低，且缺乏同类对比测试。多重 ICT 增加样本量后性能提升，分析灵敏度符合 WHO 标准，在偏远流行地区有应用潜力。
开发的 ELISA 与市场上其他血清学检测方法相当，可适应不同实验室条件，且成本较低。虽然检测存在一些交叉反应，但 ICT 可调整优化，且常用于初步筛查，后续可用其他方法确认。总体而言，基于 DTH10.1 的检测方法对 HDV 各基因型检测准确性高，为 HDV 诊断提供了新选择，虽有待优化，但在 HDV 血清学诊断和大规模流行病学调查方面有重要价值。
