CRISPR/Cas12b-MCDA 技术：布鲁氏菌属及羊种布鲁氏菌超敏高特异性检测新利器

本文开发了 CRISPR/Cas12b 核酸酶结合多重交叉置换扩增（MCDA）的检测方法（CRISPR-MCDA）。该方法能高灵敏、高特异性地检测布鲁氏菌属及羊种布鲁氏菌，整个检测过程 90 分钟内完成，或可成为极具潜力的布鲁氏菌检测工具。

　　

一、研究背景

布鲁氏菌病是由布鲁氏菌属（Brucella spp.）引起的人畜共患传染病，每年全球有超 50 万新发病例。它会引发家畜和野生动物出现波状热、慢性感染、流产和睾丸炎等症状，严重影响畜牧业发展，造成经济损失，还威胁人类健康，且目前尚无针对人类感染布鲁氏菌的特异性疫苗。

布鲁氏菌属包含 6 种 “经典” 或 “核心” 物种，其中羊种布鲁氏菌（B. melitensis）传染性最强，多数实验室获得性布鲁氏菌病病例的血清型为羊种布鲁氏菌。因此，早期准确鉴定布鲁氏菌属和羊种布鲁氏菌对控制布鲁氏菌病传播、临床管理及制定公共卫生措施至关重要。

当前，细菌培养法是鉴定布鲁氏菌病原体的标准方法，但存在检测时间长（2 - 3 天）、流程复杂、易感染实验室人员等问题。血清学检测虽快速、经济、安全且敏感性高，但特异性不足。分子技术如聚合酶链反应（PCR）敏感性高，但检测敏感性波动大（50% - 100%），且需要专业设备和控制条件，限制了其在现场即时检测（POCT）中的应用。

多重交叉置换扩增（MCDA）是新兴的等温扩增核酸分析工具，敏感性和特异性高，仅需简单恒温仪器，已用于多种病原体检测，但存在携带污染问题，不过尿嘧啶 - DNA 糖基化酶（AUDG）可解决该问题。CRISPR/Cas 系统在基因编辑等领域应用广泛，其快速、敏感、特异的特性使其可用于病原体检测等，将 CRISPR-Cas12b 与 MCDA 结合并利用纳米颗粒侧向流动生物传感器（LFB）验证结果，有望为现场监测提供高效解决方案。

二、材料和方法

1. 材料和仪器：实验所用的 MCDA 扩增试剂、AUDG、DNA 提取试剂盒、AapCas12b 核酸酶、LFB、MG 显色试剂、PCR 试剂盒等分别购自不同公司，还使用了多种检测仪器，如实时浊度仪（LA-500）、成像系统、荧光计系统等。
2. 细菌培养和 PCR 方法：样本按 2019 年布鲁氏菌病诊断标准（WS269 - 2019）接种于双相血培养瓶，在 CO₂培养箱中 37°C 培养 2 周，挑取单菌落再培养 24 小时并监测菌株生长。布鲁氏菌 PCR 检测按标准程序进行，反应体系 50 μL，包括预混 Taq、引物、DNA 模板等，经变性、退火、延伸 30 个循环。
3. 引导 RNA 和 MCDA 引物的设计与合成：利用 Primer Premier 软件（版本 5.0）设计针对布鲁氏菌属（Bcsp31）和羊种布鲁氏菌（BMEII0466）基因的 10 种引物，包括 2 种置换引物、6 种扩增引物和 2 种交叉引物，并用 BLAST 软件筛选。根据 CRISPR/Cas12b 反应原理设计 gRNA 序列，所有引物和 gRNA 由天一辉远生物技术有限公司合成。
4. DNA 模板的制备：Bcsp31和BMEII0466基因的质粒由天一辉远生物技术有限公司合成，用 Qubit4 荧光计系统定量，稀释至 2.0×10^?2 copies/μL 用于优化反应温度和检测灵敏度。临床样本按 QIAamp DNA Mini 试剂盒说明书提取 DNA，200 μL 样本加 25 μL 蛋白酶 K，涡旋混合，加缓冲液后洗脱，最终洗脱体积 100 μL。
5. CRISPR-MCDA-LFB 预扩增反应：预扩增反应体积 25 μL，包含多种引物、反应缓冲液、dNTP、MgSO₄、Bst 8.0 DNA 聚合酶、AUDG 等，先 37°C 反应 10 分钟，再 66°C 反应 50 分钟，用 LA-500、琼脂糖凝胶电泳和 MG 显色试剂确认反应可靠性和特异性。
6. CRISPR/Cas12b 介导的反式切割检测：CRISPR/Cas12b - gRNA 检测体系 20 μL，包括缓冲液、Cas12b - gRNA 复合物、单链 DNA（ssDNA）探针、MCDA 扩增产物等。Cas12b gRNA 复合物在 37°C 预孵育 10 分钟，反应温度 48°C，反应 30 分钟后用 RTF 仪器或 UV 可视化检测，并用 LFB 验证结果。
7. 纳米颗粒侧向流动生物传感器检测：反应在 48°C 恒温孵育 20 - 30 分钟，加 30 μL 无 RNase 的 ddH₂O 后插入检测条，室温孵育 5 分钟，5 分钟内目视读取结果，所有反应重复 3 次。
8. CRISPR-MCDA-LFB 检测条件的优化：用实时浊度优化 MCDA 预扩增温度（61°C - 69°C，间隔 1°C）和时间（40 - 60 分钟，间隔 10 分钟），用 RTF 仪器优化反应切割效率，测试不同反应时间（1 - 30 分钟，间隔 5 分钟），用 RTF 检测器和 LFB 验证结果。
9. CRISPR-MCDA-LFB 检测的敏感性和特异性：制备浓度为 2.0×10⁵ copies/μL 至 2.0×10^?2 copies/μL 的系列稀释质粒评估敏感性，按既定反应体系加入不同拷贝数模板 DNA，用 RTF 仪器、UV 可视化和 LFB 方法验证反式切割结果。用 28 株细菌（7 株布鲁氏菌和 21 株非布鲁氏菌）评估特异性，按既定方法加入 DNA 模板，用 LFB 验证结果。
10. CRISPR-MCDA-LFB 对临床样本检测的实用性：从贵州省疾病预防控制中心获取 64 份体液样本（54 份全血、9 份血清和 1 份脑脊液），这些样本来自初筛抗体阳性患者。样本离心混合后，按 QIAamp MinElute 病毒自旋试剂盒说明书提取 DNA，脑脊液样本需特殊处理。以细菌培养为金标准，与布鲁氏菌 PCR 检测方法比较评估 CRISPR-MCDA-LFB 的实用性。

三、结果

1. CRISPR-MCDA-LFB 检测机制：该检测方法由 MCDA 预扩增和 CRISPR/Cas12b 介导的反式切割检测组成。MCDA 预扩增以样本提取的 DNA 为模板，引物结合目标区域，Bst 8.0 DNA 聚合酶扩增产生含 PAM 位点的大量 MCDA 扩增产物。CRISPR/Cas12b gRNA 系统与扩增产物特异性结合，激活反式切割活性，切割标记生物素和猝灭剂的 ssDNA 探针。整个检测过程包括 DNA 模板提取（25 分钟）、MCDA - AUDG 预扩增反应（60 分钟）和 CRISPR/Cas12b 检测（48°C，5 分钟），90 分钟内可完成。
2. CRISPR-MCDA-LFB 检测的确认试验：用 LA-500、1.5% 琼脂糖凝胶电泳和 MG 可视化指示剂验证 MCDA 预扩增结果，阳性标本在浊度分析中有强信号，凝胶电泳产生大量产物，MG 试剂显示阳性为蓝色、阴性无色，表明 MCDA 引物扩增效果良好。用 RTF 检测器、UV 可视化和 LFB 验证 Cas12b - gRNA 介导的检测，阳性样本在 RTF 分析中有强信号，LFB 阳性结果显示 CL 和 TL 均有红线，UV 可视化结果也证实引物有效，验证了实验所用引物和 gRNA 的有效性。
3. CRISPR-MCDA-LFB 检测的最佳反应条件：优化实验表明，MCDA 预扩增的最佳反应温度为 67°C，最佳扩增时间为 50 分钟。LFB 在 5 分钟内可观察到视觉信号，RTF 仪器 1 分钟内可监测到荧光信号。
4. CRISPR-MCDA-LFB 检测的敏感性和特异性：RTF 仪器、UV 可视化和 LFB 检测的灵敏度均为 2 copies/μL，结果一致。特异性检测显示引物与非布鲁氏菌无交叉反应，仅羊种布鲁氏菌分离株检测为阳性，其他菌株为阴性，RTF 检测和 LFB 检测结果一致，证明该检测方法特异性高。
5. CRISPR-MCDA-LFB 对临床样本检测的实用性：细菌培养确认 5 份样本感染布鲁氏菌（1 份脑脊液和 4 份全血），59 份样本未感染。CRISPR-MCDA-LFB - Bcsp31检测结果与细菌培养和 PCR - Bcsp31检测结果一致（5/5）。但在 5 份布鲁氏菌属阳性样本中，PCR - B. melitensis和 CRISPR-MCDA-LFB - B. melitensis仅检测到 3 份为羊种布鲁氏菌阳性，表明另外 2 份样本可能属于其他布鲁氏菌物种。

四、讨论

布鲁氏菌病严重危害人类健康和畜牧业发展，世界卫生组织将其列为易被忽视的人畜共患病。目前传统检测方法存在诸多局限，基于 CRISPR/Cas 系统的核酸检测技术备受关注。本研究首次设计 CRISPR/Cas12b 结合 MCDA 同时检测布鲁氏菌（Bcsp31）和羊种布鲁氏菌（BMEII0466），利用特异性基因设计引物和 gRNA，该方法特异性强，用 LFB 5 分钟内可验证结果，对扩增反应设备要求低。

然而，MCDA 技术易受携带污染影响，本研究通过加入 AUDG 并用 dUTP 替代 dTTP 消除残留污染，实验证明 AUDG 效果良好。在 CRISPR-MCDA-LFB 系统中，多种检测方法验证了引物可行性，LFB 操作简便、省时，更适合现场检测。

该检测方法灵敏度高，能检测低至 2 copies/μL 的基因组 DNA，在检测低细菌载量的羊种布鲁氏菌时优势明显。同时，该方法特异性强，能准确区分布鲁氏菌属和羊种布鲁氏菌，与其他非布鲁氏菌和其他布鲁氏菌种无交叉反应。临床样本检测也证实了该方法的有效性，但对于 2 份未被 PCR - B. melitensis和 CRISPR-MCDA-LFB - B. melitensis检测为阳性的样本，考虑用全基因组测序等方法进一步鉴定。

目前该检测方法的一锅法仍需改进，存在无法满足实验室高精度检测需求、Cas 系统与等温扩增系统不兼容等问题。但总体而言，本研究建立的 CRISPR-MCDA-LFB 技术检测布鲁氏菌属和羊种布鲁氏菌具有高灵敏度、高特异性、快速等优点，有望成为临床布鲁氏菌病感染诊断的有力工具。