ATF6α 通过 GRP78-AKT1-FOXO3a 信号通路抑制 ΔNp63α 表达促进乳腺癌转移的关键机制及潜在治疗靶点研究

《Cell Death & Disease》：ATF6α inhibits ΔNp63α expression to promote breast cancer metastasis by the GRP78-AKT1-FOXO3a signaling

为探究内质网应激（ER stress）促进肿瘤转移的分子机制，成都医学院研究人员开展了 ATF6α 对乳腺癌转移影响的研究。结果发现 ATF6α 通过 GRP78-AKT1-FOXO3a 通路抑制 ΔNp63α 表达，促进乳腺癌转移。该研究为乳腺癌治疗提供新靶点。

　　在癌症的世界里，肿瘤转移就像一颗隐藏在暗处的 “定时炸弹”，是导致癌症患者死亡的主要原因。尽管现代医学在癌症治疗方面取得了不少进展，但肿瘤转移依旧是医学领域亟待攻克的难题。内质网（ER）作为细胞内蛋白质合成、折叠和分泌的重要场所，在肿瘤发展过程中扮演着关键角色。当细胞面临缺氧、营养匮乏、氧化应激等不利环境时，内质网的蛋白质折叠环境会被破坏，未折叠或错误折叠的蛋白质在其中堆积，从而引发内质网应激（ER stress）。

ER stress 激活的一系列适应性机制，即未折叠蛋白反应（UPR），包含 PERK-eIF2α、IRE1α-XBP1s 和 ATF6α 三条平行的信号分支。以往研究表明，急性 ER stress 能诱导癌细胞凋亡，为抗癌策略提供了思路；而慢性 ER stress 却会促进癌细胞的存活、增殖和转移。然而，慢性 ER stress 促进肿瘤转移的详细机制却如同迷雾，尚未完全明晰。

ΔNp63α 作为 p63 蛋白在上皮组织和上皮来源肿瘤中的主要异构体，不仅在表皮发育中起着关键的调控作用，还与肿瘤的发生发展密切相关。它能够调节细胞黏附，抑制肿瘤的转移进程。前期研究发现，缺氧诱导的 ER stress 可通过 IRE1α-XBP1s 和 ATF6α 通路下调 ΔNp63α 的表达，进而促进乳腺癌转移，但 ATF6α 抑制 ΔNp63α 促进肿瘤转移的具体机制仍有待深入探索。

为了揭开这些谜团，成都医学院临床医学院、第一附属医院的研究人员开展了一项深入研究。他们的研究成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上，为乳腺癌的治疗开辟了新的方向。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，他们培养了多种细胞系，如 MCF-10A、HCC1806、MDA-MB-231 和 HEK-293T 细胞系等。通过基因编辑技术，利用 CRISPR/Cas9 系统构建了 IRE1α 基因敲除（IRE1α-KO）细胞；运用质粒构建和慢病毒包装技术，实现了基因的过表达和干扰。同时，采用了蛋白质免疫印迹（Western blot）、定量逆转录聚合酶链反应（qPCR）、荧光素酶报告基因检测等技术来检测相关蛋白和基因的表达水平。在动物实验方面，选用 6 周龄雌性裸鼠，建立了尾静脉注射的肿瘤转移模型，用于评估肿瘤在体内的转移情况。此外，还对人乳腺癌组织芯片进行免疫组化（IHC）染色，分析相关蛋白的表达。

慢性 ER stress 通过下调 ΔNp63α 表达促进细胞迁移

研究人员利用毒胡萝卜素（TG）诱导 ER stress，研究其对细胞活力和迁移的影响。结果发现，低剂量 TG（5 nM）虽对细胞活力影响较小，但能显著促进细胞迁移。随着 TG 浓度增加，ΔNp63α 蛋白水平逐渐降低，提示 ER stress 可能通过下调 ΔNp63α 促进细胞迁移。进一步实验表明，低剂量 TG 诱导的慢性 ER stress 可加速细胞迁移，同时伴随着 GRP78（一种 ER stress 标记物）表达增加和 ΔNp63α 表达减少。恢复 ΔNp63α 表达能够恢复 E-cadherin 和 Par3 的表达，从而抑制 ER stress 诱导的细胞迁移。由此可见，下调 ΔNp63α 是 ER stress 诱导细胞迁移的核心机制。

ER stress 通过激活 ATF6α 抑制 ΔNp63α 并促进细胞迁移

研究人员通过 CRISPR-Cas9 技术构建了 IRE1α-KO 细胞，发现 TG 处理仍能下调该细胞中 ΔNp63α 及其下游靶点 E-cadherin 和 Par3 的表达，表明 ER stress 介导的 ΔNp63α 下调可能存在不依赖 IRE1α 的替代途径。在 IRE1α-KO 的 HCC1806 细胞中敲低 ATF6α，显著恢复了被 TG 下调的 ΔNp63α 蛋白表达，并抑制了慢性 ER stress 诱导的细胞迁移。相反，过表达野生型 ATF6α 可下调 ΔNp63α 表达并促进细胞迁移，而转录缺陷型突变体（R324）则无此作用，说明 ATF6α 介导的抑制 ΔNp63α 表达和促进细胞迁移依赖其转录活性。此外，体内实验也证实，ATF6α 介导的 ΔNp63α 抑制对促进肿瘤转移至关重要。综合这些结果，表明慢性 ER stress 通过激活 ATF6α 下调 ΔNp63α，进而促进细胞迁移。

ATF6α 通过 GRP78 抑制 ΔNp63α 并促进细胞迁移

研究人员发现，过表达 ATF6α 对 H3K27me3 水平影响较小，提示 ATF6α 可能通过不依赖 H3K27me3 的机制下调 ΔNp63α 表达。实验表明，ATF6α 在转录水平下调 ΔNp63α 表达，但它并非直接调控 ΔNp63α 转录。GRP78 作为 ATF6α 的靶基因，在肿瘤转移中具有重要作用。敲低 GRP78 可显著上调被 ATF6α 抑制的 ΔNp63α 的蛋白和 mRNA 水平，并抑制 ATF6α 介导的细胞迁移；而过表达 GRP78 则降低 ΔNp63α 表达，促进细胞迁移。恢复 ΔNp63α 表达可逆转 GRP78 诱导的细胞迁移增加。这些结果表明，ER stress 激活的 ATF6α 通过 GRP78 抑制 ΔNp63α 并促进细胞迁移。

GRP78 与 AKT1 相互作用，通过下调 FOXO3a 抑制 ΔNp63α

研究人员进一步探究 GRP78 调节 ΔNp63α 基因转录的机制，发现过表达 GRP78 仅显著下调 FOXO3a 表达，且与 ΔNp63α 水平降低一致。通过生物信息学分析和染色质免疫沉淀（ChIP）实验证实，FOXO3a 可直接结合到 ΔNp63 基因启动子上，激活其表达。恢复野生型 FOXO3a 表达可上调被 GRP78 下调的 ΔNp63α 表达，而突变型 FOXO3a 则无此作用。GRP78 通过蛋白酶体途径促进 FOXO3a 降解，且 GRP78 与 AKT1 相互作用，敲低 AKT1 可减少 GRP78 诱导的 FOXO3a 泛素化，提高 FOXO3a 和 ΔNp63α 蛋白水平。综上所述，GRP78 通过与 AKT1 相互作用促进 FOXO3a 降解，从而抑制 ΔNp63α 表达。

抑制 AKT1 可恢复 GRP78 介导的细胞迁移和肿瘤转移

研究人员使用 AKT 抑制剂 MK2206 处理 GRP78 过表达的 HCC1806 细胞，发现抑制 AKT 活性可恢复被 GRP78 抑制的 FOXO3a 蛋白水平，进而恢复 ΔNp63α 的蛋白和 mRNA 表达，并抑制 GRP78 介导的细胞迁移。体内实验显示，MK2206 可有效抑制 GRP78 过表达细胞在小鼠肺部的转移结节形成。敲低 ΔNp63α 可促进细胞迁移，而抑制 AKT1 则可恢复 ΔNp63α 表达并抑制细胞迁移。这些结果表明，抑制 AKT1 可通过上调 ΔNp63α 逆转 GRP78 介导的细胞迁移和肿瘤转移。

乳腺癌中 TP63 与 ATF6α/GRP78 的表达模式相反

通过分析公共数据库和对人乳腺癌活检样本的免疫组化分析，研究人员发现乳腺癌组织中 TP63（编码 ΔNp63α）和 FOXO3a 的表达明显低于正常组织，而 ATF6 和 GRP78 的表达则显著升高。此外，低 TP63 表达、高 ATF6 表达和高 GRP78 表达与乳腺癌患者的不良预后相关。

综上所述，该研究揭示了 ATF6α 通过 GRP78-AKT1-FOXO3a 信号通路抑制 ΔNp63α 表达，进而促进乳腺癌转移的分子机制。这一发现为理解乳腺癌转移的机制提供了新的视角，也为乳腺癌的治疗提供了潜在的靶点。尽管研究存在一定局限性，如主要基于三阴性乳腺癌（TNBC）模型，且动物模型未能完全模拟肿瘤转移的自然过程，但依旧为后续研究奠定了重要基础，有助于推动乳腺癌治疗领域的进一步发展。