脑类器官：构建高阶复杂性和神经回路模型

《TRENDS IN Biotechnology》：Brain organoids: building higher-order complexity and neural circuitry models

这篇综述聚焦脑类器官（Brain organoids），详细阐述其在模拟人类大脑发育和疾病研究中的进展。涵盖构建复杂类器官、重建神经回路，以及解决细胞死亡、血管化等问题，为理解大脑疾病机制和开发新疗法提供重要参考。

　　

脑类器官 —— 以简单驱动复杂

理解脑部疾病的分子机制需要在动物和人类模型中进行广泛研究。人类和啮齿动物的大脑发育存在显著差异，一些脑部疾病的小鼠模型也有缺陷，这使得使用人类大脑模型成为必要。获取人类脑组织困难，且对死后组织的研究有限，促使该领域开发人类大脑的体外模型。多能干细胞（PSCs）为在二维和三维培养中生物工程化人类脑细胞提供了前所未有的机会。

脑类器官是自组织的三维细胞系统，包含不同的脑细胞类型，能生成具有类似不同脑区功能特征的结构。二维培养可单独研究人类大脑的特定细胞类型，而类器官能重现更多人类大脑的结构复杂性，如细胞多样性、多种细胞类型和层次的协同作用，还能重现人类大脑的基因表达谱、表观遗传景观和一些突触功能。

在成功构建出能重现多个混合脑区特征的简单 “通用” 类器官后，人们开始思考能否开发出重现特定脑区的类器官，以及能否在体外模型中重建体内观察到的区域间神经回路。近年来，人们投入大量精力消除类器官模型的其他限制，如开发用于研究衰老和与衰老相关疾病的类器官培养条件和类器官。本综述重点关注其他近期综述未涵盖的重要方面，即类器官模型和培养技术在重现神经回路、记录电活动方面的进展，以及如何克服类器官的主要限制，以最大化其在脑部疾病研究（包括与衰老和神经退行性疾病相关的研究）中的潜力和应用。

构建高阶复杂性的脑类器官

过去十多年间，人们生成了多种简单形式的脑类器官，但它们存在两个主要限制。其一，由 PSCs 自发分化形成的脑 / 大脑类器官只能重现一种初级的类似脑组织的结构，其中包含多个混合且无序的脑区，界限不清晰。为此，人们努力开发脑区特异性类器官，通过在体外重现驱动每个脑区神经发育的模式形成线索和形态发生信号来实现（图 1）。

例如，在类器官诱导的最初几天，通过双重 SMAD 抑制（BMP 抑制 + TGF-β 抑制）诱导神经外胚层命运，随后使用 WNT 和 TGF-β 抑制将类器官导向皮质命运，或通过 WNT 抑制、TGF-β、RXR 和 SHH 刺激，利用外侧神经节隆起（LGE）细胞诱导纹状体命运。利用 WNT 抑制加上 FGF-β、EGF 和 SHH 刺激开发出具有内侧神经节隆起（MGE）特征的亚皮质类器官。通过双重 SMAD 抑制，然后用 BMP7、胰岛素和 MEK 抑制剂处理，可生成丘脑类器官。激活 WNT 通路，同时激活 BMP 通路或抑制 SHH 通路可诱导海马体类器官的生成，调节 WNT 通路，结合 BMP 抑制、SHH 激活和 FGF-β 可实现下丘脑的特化。对于中脑类器官的特化，已有多种方案，利用 BMP 和 TGF-β 抑制剂以及 WNT、SHH 和 FGF-8 通路激活剂。此外，通过使用视黄酸（RA）和 / 或 FGF 通路刺激剂进行尾侧命运模式形成，开发出了重现后脑和脊髓的类器官。

除了这些模式形成线索和信号通路调节剂，通常还会向培养基中添加神经营养因子，如脑源性神经营养因子（BDNF）和胶质细胞源性神经营养因子（GDNF），以促进类器官的成熟。除了直接向类器官培养物中添加形态发生素，最近开发的一种方法是在微流控装置中，使 PSCs 或胚状体同时暴露于多个正交的形态发生素梯度中，这使得化学梯度更易控制，能同时生成神经管或不同脑区的类器官。总之，在类器官发育过程中，在正确的时间控制命运决定线索和信号转导通路，能够生成大量特定脑区的类器官。

神经回路

先前脑类器官模型的第二个限制是无法重现体内多个脑区之间发生的相互作用，包括信号转导级联、细胞间的相互作用、细胞迁移，以及两个或多个脑区之间形成的神经回路。一种开创性的解决方案是将单独培养的脑区特异性类器官融合，生成 “多区域组装体”（图 2）。

组装体的融合方式有多种，比如将单个类器官或球体一起包埋在基质胶滴中，或者在微量离心管或培养板中共培养数天。例如，通过将含有谷氨酸能神经元的单独诱导的背侧前脑 / 大脑皮层类器官与含有 γ- 氨基丁酸（GABA）能神经元的腹侧前脑 / 亚皮质类器官融合，开发出前脑组装体。这些前脑组装体重现了背腹轴和 GABA 能中间神经元的迁移，并显示出轴突投射的延伸和突触组装的形成，为研究对皮层回路形成至关重要的中间神经元迁移，以及理解 Timothy 综合征中皮层中间神经元迁移缺陷的分子机制提供了模型。另一种用于研究中间神经元迁移的组装体模型，是通过融合 MGE 和皮层类器官构建的，其中中间神经元从 MGE 类器官迁移并整合到皮层类器官中，形成兴奋性突触后密度。

重要的是，组装体能够实现长距离神经元活动和回路形成，可通过钙成像或电生理记录进行分析。例如，在 MGE 和皮层组装体中，通过钙瞬变和活跃的钙激增观察到迁移的中间神经元的正常活动。能够重现皮质丘脑皮质回路的皮质丘脑组装体，显示出与体内丘脑核和皮层之间相似的相互丘脑皮质投射。有趣的是，皮质丘脑组装体中的丘脑神经元比未融合的丘脑类器官中的神经元具有更高的放电频率，这表明组装体内存在功能相互作用。此外，融合纹状体和中脑类器官以模拟基底神经节的一部分，显示出电生理活跃的黑质纹状体和纹状体黑质通路。在这些纹状体 - 中脑组装体中过表达 α- 突触核蛋白（α-syn），可观察到 α-syn 沿多巴胺能轴突从纹状体向中脑类器官的运输，并引发类似于帕金森病（PD）的黑质纹状体系统损伤。网络分析表明，纹状体 - 中脑组装体的网络爆发频率和每次爆发的尖峰数量高于单个纹状体和中脑类器官，这表明组装体的网络活动更高。

光遗传学可与钙成像或电生理学相结合，有助于分析特定神经元细胞类型中神经元活动的时空模式。例如，通过融合皮层和纹状体类器官开发出皮质纹状体组装体，其中包含皮质纹状体投射，皮层神经元向纹状体类器官发送轴突投射，并在那里与中等棘状神经元（MSNs）形成突触。对这些组装体中的皮层神经元进行光遗传学刺激，可导致纹状体 MSNs 中诱发钙反应。结合电生理学，光遗传学刺激皮层神经元可诱导 MSNs 放电，并诱发兴奋性突触后电流和电位，进一步证明皮层神经元与纹状体类器官中的 MSNs 形成了功能性突触连接。将具有功能性 MSNs 的纹状体类器官与中脑黑质类器官组装在一起，MSNs 从纹状体延伸投射到黑质，并与 GABA 能神经元形成突触连接。钙成像显示，与单个纹状体类器官相比，组装体中的神经元活动增加。此外，对纹状体神经元进行光遗传学刺激，可在黑质神经元中诱发抑制性突触后电流，表明纹状体和黑质类器官中的神经元之间形成了突触连接。这些结果表明，这些组装体可用于模拟与研究运动障碍相关的纹状体黑质回路。此外，丘脑皮质组装体已被用于研究钙电压门控通道亚基 α1G（CACNA1G）基因变体的回路水平效应。对间脑类器官（丘脑谷氨酸能神经元的发育前体）进行光遗传学刺激，可增加皮层类器官中神经元的放电率和钙反应。

更复杂的成果是融合多个（即多于两个）脑区特异性类器官或神经结构，形成三向或四向组装体（图 2）。例如，开发出包含皮层类器官、脊髓类器官和骨骼肌球体的皮质运动组装体，其中皮层类器官中的神经元与脊髓类器官相连，并激活肌肉球体产生收缩。狂犬病病毒示踪、钙成像和膜片钳记录表明，皮质传出神经元投射并连接到脊髓类器官的运动神经元，而运动神经元又连接到肌肉球体。用谷氨酸去笼化对皮层类器官进行光刺激，可导致肌肉收缩，这表明存在皮质脊髓肌肉功能单元。类似地，将大脑或中脑类器官与多个运动神经元球体组装在一起，并连接到固体基质上的肌肉束。在这个系统中，刺激类器官可诱导肌肉束运动，用谷氨酸或左旋多巴处理大脑或中脑类器官，可增加相应的电生理信号，包括电压、尖峰数量和平均放电率。这些电生理信号传递到肌肉束，增加了肌肉运动，表明可以开发出功能性的脑 - 运动系统。此外，将皮层和丘脑类器官与视网膜类器官组装在一起，重建视觉回路。在这些组装体中，视网膜神经节细胞的轴突深入组装体，重现了视觉系统的投射，丘脑类器官中的星形胶质细胞也迁移到视网膜类器官中，类似于这些区域在体内的相互作用。通过组装皮层、间脑、背侧脊髓和躯体感觉类器官，开发出四脑区组装体，旨在重现人类上行脊髓丘脑通路。在这些组装体中，对感觉神经元进行光遗传学刺激，信号通过脊髓和丘脑神经元传递到皮层神经元，所有其他区域的钙水平都有所增加。这些先进的类器官模型重现了体内神经回路和脑区相互作用，在解构复杂动物行为（从运动和感觉功能到认知和执行功能）的回路组件方面具有巨大潜力。例如，涉及皮层、皮质海马、皮质丘脑皮质、中脑皮质、基底神经节和 Papez 回路的记忆形成过程，可能可以使用组装体模型进行研究。此外，皮质丘脑和皮质丘脑皮质组装体可能有助于研究感觉处理、意识和学习。涉及中脑皮质通路和基底神经节回路的奖赏相关行为，可通过前脑 - 中脑和中脑 - 纹状体组装体进行研究。此外，脑 - 肿瘤组装体模型推动了肿瘤 - 脑相互作用研究的发展（方框 1）。尽管组装体具有上述巨大潜力，但仍存在挑战，例如缺乏将类器官融合成组装体的标准方法，导致组装体之间存在差异；使用传统融合方法无法重现脑区之间的白质，使得组装体模型不适合研究轴突束，而轴突束是区域间功能连接的重要特征（方框 2）。然而，最近的技术有助于解决这些挑战。

类器官中的突触功能和电活动

前面描述的改进后的类器官模型显示出成熟突触和电活动神经元网络的证据，这是进行深入神经科学研究的基本特征。例如，在中脑类器官中，用相应标记物标记的突触前和突触后末端之间观察到了突触发生。对大脑类器官中的神经元进行稀疏标记，也揭示了树突棘结构的存在。此外，电子显微镜证明了大脑类器官中存在充满囊泡的突触结构。

在发育中的大脑中，自发的电活动独立于感觉输入出现，在神经回路形成、神经元迁移和成熟过程中发挥重要作用。通过钙成像和电生理学，已在不同的类器官模型中证明了神经元的电活动。钙成像和基因编码的钙指示剂（GCaMPs）已用于标记类器官中的神经元，并证实类器官神经元的钙活动可被钠通道阻滞剂河豚毒素阻断。类似于体内小脑回路模式的细胞内钙动态，表明小脑类器官中存在功能成熟的网络活动，且类器官中的浦肯野细胞对功能性神经网络的形成有积极贡献。为了精确测量突触功能，从类器官进行电生理记录的方法迅速发展（图 3）。全细胞膜片钳技术已用于记录脑类器官中单个神经元的细胞膜电生理特性和细胞内动作电位，可提供具有高时间分辨率的单个神经元活动记录，但较低的空间范围限制了对复杂网络活动的检测。此外，多电极阵列（MEAs）可用于监测类器官内神经元网络的活动，以及网络活动随时间的演变。例如，MEAs 记录显示，用诱发疼痛的化学物质处理脊髓类器官后，其平均放电率增加，证明了模拟伤害感受回路的可行性。此外，用 MEAs 记录 2 个月至 10 个月大的大脑类器官中神经元的电活动，观察到网络事件或多个电极上的同步放电，以及在约 4 个月时开始出现的嵌套振荡事件，这些事件在约 10 个月时转变为更强、更具变化性的振荡，这些模式类似于一些早产儿脑电图（EEG）记录。在中脑类器官中，可使用多巴胺受体激动剂喹吡罗调节神经元的放电频率。使用钙成像和 MEAs 记录脑类器官中功能活动的方法，为在突触和网络水平记录神经元网络提供了有价值的标准化方法。

然而，使用 MEAs 记录神经活动的一个局限性是，MEAs 通常植入类器官底部并主要从底部记录，因此无法记录所有类器官神经元的活动。作为解决方案，传统的二维 MEAs 已被改进为三维 MEAs，能够在整个类器官中可靠地记录功能性神经网络。然而，将三维 MEAs 插入类器官不可避免地会对类器官造成损伤。因此，开发了一种新的微制造三维框架，即三维多功能中尺度框架（3D MMF），它可以包裹类器官，其电接口能够在不损伤类器官的情况下进行记录。二维柔性电子器件被折叠成设计好的三维结构，精确匹配将集成到 3D MMF 中的类器官的形态，从而可以通过与类器官表面的紧密接触来监测其电生理活动。3D MMF 已用于记录波传播、放电和爆发事件，对类器官的损伤较小。类似地，由可调聚合物薄片和导电聚合物涂层金属电极制成的三维形状的壳状 MEAs，可根据不同大小的类器官进行调节，有助于在不破坏类器官内部结构的情况下对类器官进行长期记录。另一种高度可拉伸的三维双 MEAs 装置，通过使用电极 “口袋” 状设计，在记录时能够实现连续的介质交换，其中一对制造好的可拉伸 MEAs 垂直排列在 “口袋” 周围。此外，为了实现对类器官中单个细胞电生理学的长期三维记录，设计了在网格中使用蛇形结构的弹性组织状纳米电子器件。干细胞与弹性纳米电子器件共培养，并通过折叠纳米电子器件来重建脑类器官，这些被称为 “半机械人器官 oid”。这些弹性纳米电子器件可以拉伸以适应组织生长，并可以连接到外部记录装置进行长期测量。因此，干细胞衍生的神经元细胞与纳米电子器件紧密接触，在类器官发育过程中可以记录细胞活动作为单细胞电生理学数据。进一步改进的半机械人器官 oid，使用基于液态金属聚合物导体的网状神经接口，在海马体类器官中显示出神经尖峰、同步和振荡活动。然而，尽管这是一种有前途的、用于从类器官进行长期稳定电生理记录的技术，但半机械人器官 oid 中的细胞必须从类器官诱导开始就与纳米电子器件接触，这不可避免地会干扰类器官的细胞结构和发育。因此，开发了一种新的三维折叠电记录平台 —— 折纸电子学，它由超薄电极组成，可以在几何形状上适应悬浮的类器官，从而实现它们的长期整合，并持续记录脑类器官中的神经元活动。

增强脑类器官模型的能力

以前的脑类器官模型存在严重问题，限制了其能力和潜在应用。最近的创新策略，如长期培养装置和包含血管和微胶质细胞的多谱系组装体，显著缓解了这些限制（图 2）。下面总结以前类器官模型的一些主要限制，以及为解决这些问题而设计的方法，这些方法显著增强了类器官模型的能力。

脑类器官中的细胞死亡

培养类器官是一个漫长的过程，面临诸多挑战，其中包括在培养过程中类器官内的细胞死亡，这可能是由于氧气和营养物质无法充分渗透到类器官核心。因此，在类器官培养过程中引入了振荡培养方法（方框 3 和图 4）。另一种增强营养物质进入类器官内部的策略是将类器官切片，在气液界面进行培养，这增强了神经元的存活和成熟（图 4）。或者，为避免切片，将完整的脑类器官在微流控平台上培养，该平台结合了可灌注的培养室、气液界面和 “一站式” 方案（图 4），这种微流控平台最大限度地减少了缺氧核心的形成，提高了类器官的均匀性。

此外，尝试对类器官进行血管化，以增强营养物质向类器官核心的输送，减少细胞死亡，并重现血脑屏障（BBB）。将类器官与来自相同诱导多能干细胞（iPSC）系的内皮细胞共包埋在基质胶中，类器官周围形成了类似血管的管状结构。或者，从诱导开始就将 PSCs 或 PSCs 衍生的神经祖细胞（NPCs）与内皮细胞共培养，或者将来自 PSCs 或脐静脉内皮细胞的血管球体与脑类器官组装在一起，都可导致血管生成。将血管类器官与大脑类器官组装在一起，有助于在体外模拟 BBB 的特征，并有助于模拟神经血管相互作用，特别是在脑海绵状畸形的研究中。此外，类器官芯片方法已被用于重现 BBB。类器官芯片由包含类器官的微流控通道和腔室组成，类似于计算机芯片。这允许培养基在微流控系统中通过血管化的类器官流动，实现血管细胞和类器官之间的时间同步和空间定向，增强神经元分化，并减少细胞死亡（图 4）。使用类器官芯片平台对人类 BBB 进行进一步研究，可能有助于使用 iPSC 衍生的脑类器官和微流控类器官芯片装置中的内皮细胞，对个体患者的 BBB 特性进行精准医学测试。

漫长