Rapgef3 调控巨噬细胞重编程，加剧机械过载下的滑膜炎和骨关节炎：潜在治疗靶点的新发现

《iScience》：Rapgef3 modulates macrophage reprogramming and exacerbates synovitis and osteoarthritis under excessive mechanical loading

为探究机械应力、滑膜巨噬细胞与骨关节炎（OA）的关系，研究人员开展了 Rapgef3 在 OA 中作用的研究。结果表明，Rapgef3 促进巨噬细胞炎症，导致关节软骨损伤，关节内敲除 Rapgef3 可改善症状。这为 OA 治疗提供了潜在靶点。

　　骨关节炎（Osteoarthritis，OA）是一种极为常见的慢性关节疾病，常常 “盯上” 膝关节和髋关节 。它的出现与性别、体重、年龄以及过度的压力等众多因素紧密相关。随着 OA 病情的发展，患者的运动功能会逐渐受损，严重时甚至会残疾，这不仅极大地降低了患者的生活质量，还为国家和个人带来了沉重的经济负担。

在关节的健康维护中，适当的机械应力至关重要，然而过度的机械加载却如同 “破坏分子”，会引发关节软骨的退变，进而加速 OA 的发展。近年来，临床实践发现多数 OA 患者的膝关节轴不对称，致使力的分布不均，进一步加剧了滑膜增生和软骨磨损。尽管机械加载在 OA 中的重要性已被认知，但过度机械加载对关节滑膜细胞的具体影响仍不明确。

同时，滑膜炎在 OA 的发展进程中扮演着重要角色，它会增加 OA 的发病风险，引发一系列不良后果，如促使血管翳和破骨细胞形成、增强滑膜组织与软骨的粘连，以及释放炎症介质，最终导致关节软骨的破坏。滑膜巨噬细胞作为滑膜炎和 OA 中的关键参与者，可分为促炎巨噬细胞和抗炎巨噬细胞，它们之间的平衡一旦被打破，就与膝关节 OA 的严重程度密切相关。不过，OA 的发病机制至今尚未完全明晰。

为了深入探究这些问题，南方医科大学第三附属医院等机构的研究人员开展了相关研究 。研究发现，过度机械加载会刺激培养的 Raw246.7 细胞中的促炎巨噬细胞，并且识别出了 Rapgef3。研究人员推测 Rapgef3 与过度机械加载导致的 OA 之间存在关联，于是决定深入研究其在 OA 中的潜在作用 。该项研究成果发表在了《iScience》杂志上。

研究人员在实验过程中运用了多种关键技术方法。在细胞实验方面，对 RAW246.7 细胞和原代小鼠软骨细胞进行培养，并通过转染技术改变细胞内 Rapgef3 的表达水平 。同时，构建了 OA 小鼠模型，通过手术和病毒注射的方式干预小鼠体内 Rapgef3 的表达 。此外，还利用 RNA 测序、免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）、免疫荧光染色（Immunofluorescence，IF）、定量逆转录聚合酶链反应（Quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-qPCR）和蛋白质免疫印迹（Western blot analysis，WB）等技术，对相关指标进行检测和分析 。研究中使用的样本队列包括来自交通事故患者的正常滑膜样本和 OA 患者的滑膜样本，以及实验小鼠的关节样本。

下面来详细看看具体的研究结果：

1. 过度机械加载和 OA 滑膜中巨噬细胞 Rapgef3 表达增加：研究人员对 RAW264.7 细胞施加不同强度和时长的循环拉伸应变加载处理，发现低机械负荷（0.5Hz 和 5% 循环拉伸应变加载 24 小时）可使巨噬细胞呈现抗炎功能，而高机械负荷（10% 和 20% 循环拉伸应变加载 24 小时）则增强促炎巨噬细胞的功能 。通过 RNA 测序，研究人员发现 Rapgef3 在过度机械加载诱导的促炎巨噬细胞中稳定且显著上调 。对 OA 患者和 DMM-OA 小鼠的滑膜组织进行检测后发现，Rapgef3 在人 OA 滑膜组织以及 DMM-OA 小鼠滑膜巨噬细胞中的表达均显著增加 。这表明过度机械加载会导致巨噬细胞的促炎反应增强，同时 Rapgef3 的表达增加，并且这种变化与 OA 的进展密切相关 。
2. Rapgef3 增强巨噬细胞的促炎作用，抑制 Rapgef3 可减轻促炎反应：研究人员将不同浓度的 Rapgef3 过表达质粒转染到 RAW246.7 细胞和 BMDMs 中，发现 Rapgef3 过表达能够增强巨噬细胞的促炎作用，抑制其抗炎作用 。相反，通过转染 Rapgef3 小干扰 RNA（siRNA）敲低 Rapgef3 后，巨噬细胞的促炎方向受到抑制 。在经过 0.5Hz 和 20% 循环拉伸应变加载处理的 RAW246.7 细胞中敲低 Rapgef3，过度机械加载诱导的促炎方向增强被显著抑制，抗炎方向的抑制也得到了逆转 。这充分说明 Rapgef3 能够增强巨噬细胞的促炎作用、抑制抗炎作用，而敲低 Rapgef3 则可以缓解过度机械加载导致的促炎 / 抗炎失衡 。
3. Rapgef3 对软骨细胞无直接作用：免疫组化结果显示，Rapgef3 在 DMM-OA 小鼠的滑膜巨噬细胞中显著增加，但在关节软骨上几乎不表达 。将 Rapgef3 过表达质粒转染到原代小鼠软骨细胞中，不同浓度的质粒并未使原代小鼠软骨细胞中的 MMP13、COL2、SOX9 或 P21 产生显著变化 。由此可见，Rapgef3 对软骨细胞没有直接影响 。
4. Rapgef3 通过调节巨噬细胞的促炎反应间接导致软骨细胞代谢紊乱：研究人员收集经脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS）或 Rapgef3 过表达质粒处理 72 小时的巨噬细胞上清液，并与软骨细胞进行共培养 。结果发现，LPS 处理的巨噬细胞培养上清液以及过表达 Rapgef3 的巨噬细胞培养上清液，均能促进原代软骨细胞中 MMP13 的表达，抑制 COL2 和 SOX9 的表达 。此外，与过度机械加载处理的巨噬细胞上清液共培养的软骨细胞，其 MMP13 和 P21 水平上调，COL2 和 SOX9 受到抑制，而敲低巨噬细胞中的 Rapgef3 则可逆转这些变化 。用 OE-Rapgef3 巨噬细胞上清液培养小鼠胫骨平台软骨外植体，会导致明显的蛋白多糖损失，而敲低巨噬细胞中的 Rapgef3 则能显著减轻这种损失 。这表明 Rapgef3 并非直接损伤软骨细胞，而是通过介导巨噬细胞极化间接造成软骨细胞损伤 。
5. 抑制 Rapgef3 可逆转小鼠的滑膜炎和软骨损伤：研究人员将携带 Rapgef3-siRNA 的慢病毒转染到 RAW246.4 细胞中，敲低 Rapgef3 的表达 。然后对 10 周龄雄性 C57 小鼠进行 DMM 手术后，每周两次向其膝关节腔内注射慢病毒 。结果发现，与对照组相比，敲低 Rapgef3 能够逆转滑膜炎和软骨损伤，具体表现为滑膜炎评分和骨关节炎研究协会国际（Osteoarthritis Research Society International，OARSI）评分降低，同时胫骨软骨中 COL2 和 SOX9 的表达上调，MMP13 的表达降低 。这意味着降低 Rapgef3 的表达可以缓解 OA 发展过程中的滑膜炎症和软骨细胞代谢紊乱 。
6. Rapgef3 通过激活 p65/NF-κB 通路促进巨噬细胞炎症：研究表明，Rapgef3 能够激活 NF-κB 通路，而该通路在 OA 中过度激活，会加剧滑膜炎、诱导促炎巨噬细胞的产生，并导致软骨细胞基质降解 。在细胞水平上，Rapgef3 过表达会激活巨噬细胞中的 p65/NF-κB 通路，0.5Hz 和 20% 循环拉伸应变加载处理也会激活该通路，而敲低 Rapgef3 则会抑制 p65 的磷酸化 。在体内实验中，敲低 Rapgef3 同样会抑制滑膜巨噬细胞中的 p65/NF-κB 通路 。因此可以得出结论，巨噬细胞中的 Rapgef3 通过激活 p65/NF-κB 通路，促进了促炎巨噬细胞的产生，进而加剧了滑膜炎和软骨退变，最终使 OA 病情恶化 。

在讨论部分，研究人员指出，他们首次证实了 Rapgef3 在 OA 发病机制和进展过程中，对介导巨噬细胞极化和间接影响软骨细胞合成代谢起着关键作用 。过度机械加载会使滑膜巨噬细胞中的 Rapgef3 表达上调，通过 NF-κB 信号通路影响巨噬细胞极化，进而加剧滑膜炎症，破坏软骨细胞的稳态 。这一发现揭示了 OA 发展过程中的一条重要功能通路，表明抑制关节内的 Rapgef3 可能是预防和治疗 OA 的一种潜在策略 。

尽管目前在 OA 中抑制 Rapgef3 的临床证据尚不足，但调节巨噬细胞极化有望成为延缓 OA 进展的潜在策略 。此外，研究还存在一定的局限性，例如用 0.5Hz 和 20% 循环拉伸应变加载处理的巨噬细胞上清液培养软骨细胞，会影响软骨细胞的衰老指数（P21 增加），但用 Rapgef3 过表达的巨噬细胞上清液培养软骨细胞，却对软骨细胞衰老没有影响，这表明软骨细胞的衰老可能还受其他介质的调节 。不过，该研究首次报道了在过度机械加载下，Rapgef3 诱导的滑膜炎会进一步影响软骨细胞，加重 OA 病情，为后续研究指明了方向 。总的来说，这项研究为深入理解 OA 的发病机制提供了新的视角，为 OA 的治疗开辟了潜在的新途径，具有重要的科学意义和临床应用价值 。