寨卡病毒反向遗传系统的开发及拯救毒株的特征鉴定：为防控病毒威胁奠定关键基础

《Veterinary Research》：Development of a reverse genetics system for Getah virus and characterization of rescued strains

Getah 病毒（GETV）严重威胁动物安全和公共卫生，且缺乏有效防控手段。安徽农业大学研究人员构建了 GETV 的 DNA 启动感染性克隆和携带 EGFP 报告基因的重组病毒。结果显示，拯救病毒具有与亲本病毒相似的生物学活性，该研究为 GETV 相关研究及防控提供了重要工具。

　　Getah 病毒（GETV）是一种由蚊子传播的甲病毒，近年来其感染事件在全球多地频繁发生，给畜牧业带来了巨大损失，还对公共卫生构成潜在威胁。目前，针对 GETV 既没有特效的抗病毒药物，也缺乏有效的疫苗，这使得对该病毒的研究和防控工作面临严峻挑战。为了深入了解 GETV 的生物学特性、致病机制，开发出有效的防控策略，安徽农业大学的研究人员开展了一系列研究。他们成功构建了 GETV 的 DNA 启动感染性克隆，并对拯救毒株进行了特征鉴定。这一研究成果发表在《Veterinary Research》杂志上，为后续 GETV 的研究和防控提供了重要的理论依据和技术支持 。

研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是基因克隆技术，将 GETV HuN1 株的全基因组进行分段克隆，构建包含病毒全基因组的重组质粒；其次利用脂质体转染技术，将构建好的感染性克隆质粒转染到 BHK-21 细胞中进行病毒拯救；此外，还运用了免疫荧光测定（IFA）、噬斑测定、蛋白质免疫印迹（Western blot）等技术对拯救病毒进行检测和分析。

构建全长感染性克隆及含遗传标记的克隆

研究人员将 GETV HuN1 株的整个基因组分为八个片段，克隆并插入到 pBR322 载体中。构建的 DNA 启动感染性克隆在病毒基因组 5’端含有巨细胞病毒立即早期（CMV）启动子，3’端包含 25 个核苷酸的 poly (A) 尾、丁型肝炎病毒核酶（HdvRz）和牛生长激素（bGH）信号序列。同时，构建了含增强绿色荧光蛋白（EGFP）的感染性克隆。经测序分析，证实两个克隆与亲本 GETV HuN1 株完全一致，且成功插入了亚基因组启动子（SG promoter）和 EGFP 基因。

拯救病毒的细胞病变效应及病毒粒子观察

转染 pBR322-GETV-HuN1 质粒获得的重组病毒在第二代传代时就出现明显的细胞病变效应（CPE），如细胞变圆、收缩、融合和脱落等，且随着传代次数增加，CPE 愈发明显，而对照组细胞形态正常。通过负染透射电镜观察到拯救病毒粒子（rGETV-HuN1 和 rGETV-EGFP）平均直径约 70nm，感染 BHK-21 细胞的超薄切片也证实了病毒粒子的存在，表明反向遗传获得的感染性克隆诱导的 CPE 和生物结构与野生型病毒相似。

重组病毒的产生及特性分析

通过噬斑测定和一步生长曲线分析评估拯救病毒的生物学活性。噬斑分析显示，rGETV-HuN1 的平均噬斑直径最大，与 rGETV-EGFP 和 GETV-HeN 相比有显著差异。生长曲线表明，拯救病毒的复制动力学和生长模式与亲本病毒相似，这确认了拯救的 Getah 病毒保留了与野生型病毒相当的生物学活性。

拯救病毒及基因标记拯救病毒的 IFA 检测

利用针对 GETV 衣壳蛋白（Cap）的多克隆抗体进行免疫荧光测定（IFA），结果显示在感染细胞中，亲本病毒和拯救病毒组均有明显的荧光信号，而阴性对照组无荧光，证实了反向遗传获得的 Getah 病毒感染性克隆成功拯救。

拯救病毒的遗传稳定性和复制能力

蛋白质免疫印迹（Western blot）分析表明，病毒复制过程中 Cap 蛋白表达稳定；激光共聚焦显微镜观察发现，随着传代次数增加，表达 EGFP 的病毒粒子逐渐增多；实时荧光定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）分析显示，rGETV-HuN1 中 Cap 表达和 rGETV-EGFP 中 EGFP 表达先上调后稳定。这些结果共同证明拯救病毒具有高感染性且能稳定表达 EGFP。

拯救病毒在小鼠中的致病性

给 3 日龄 ICR 乳鼠颅内注射亲本病毒或拯救病毒（1 MOI / 只），对照组注射等量 DMEM。结果显示，感染组在 84 h 内死亡率达 70%，而对照组无症状且正常生长。感染小鼠 84 h 时体重显著低于对照组，在感染 48/84 h 后，检测心脏、肠道、肺和脑组织中的病毒滴度（TCID₅₀）发现，病毒在脑内特异性积累，且 84 h 时脑内病毒滴度高于 48 h。

感染病毒小鼠的器官病变和组织变化的病理评估

感染后，小鼠出现厌食、嗜睡、肛周流黄水和神经抑制等症状，72 h 时出现明显驼背和生长迟缓。大体病理显示，感染小鼠胃容积减小、胃腔空虚；神经病理学检查发现脑血管充血、血管周围炎症和微血栓形成，伴有大量炎性细胞浸润；肺组织有明显的肺泡间质充血和增生；肠道病理表现为绒毛上皮脱落和乳糜泻；心脏组织出现炎症浸润、肌纤维排列紊乱和心脏肥大。

研究人员成功构建了 GETV 的反向遗传系统，包括全长感染性克隆和携带 EGFP 报告基因的克隆，并对拯救病毒的生物学特性、遗传稳定性、致病性等进行了全面分析。该研究成果为深入理解 GETV 的分子生物学机制、致病机制、开发疫苗以及研究病毒与宿主的相互作用提供了重要工具，有助于推动 GETV 相关疾病的防控研究，对保障动物健康和公共卫生安全具有重要意义。