抑制 TGF-β/SMAD 信号通路的新机制：核内膜磷酸酶复合物的关键作用

在细胞信号传导研究中，为探究 R-SMADs 在细胞核内的失活机制，研究人员开展了关于 TGF-β/SMAD 信号通路的研究。结果发现 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶复合物可使 R-SMADs 去磷酸化，该发现揭示了 TGF-β 信号失活机制，对理解相关疾病意义重大。

　　在生命科学的微观世界里，细胞信号传导如同精密的 “通信网络”，掌控着细胞的命运。其中，转化生长因子 -β（TGF-β）超家族细胞因子通过受体调节的 SMAD（R-SMAD）转录因子，在细胞分化、增殖、死亡等诸多关键进程中扮演着核心角色。当 TGF-β 超家族细胞因子与靶细胞表面的同源受体结合后，受体激酶被激活，R-SMADs 的 C 末端 SXS 基序中的丝氨酸残基发生磷酸化，激活后的 R-SMADs 与 SMAD4 结合形成复合物，转移至细胞核内调节基因表达。

然而，这个 “通信网络” 的关闭机制却长期困扰着科研人员。虽然知道 R-SMADs 的激活由磷酸化启动，但对于其在细胞核内如何通过去磷酸化失活，从而精准调控 TGF-β 信号通路，科学界一直未能达成共识。此前有研究认为蛋白磷酸酶 Mg²⁺/Mn²⁺依赖的 1A（PPM1A）可能参与 R-SMADs 的去磷酸化，但后续研究发现 PPM1A 似乎是通过促进 R-SMADs 的核输出间接发挥作用，且 PPM1A 基因敲除小鼠并未出现 TGF-β/SMAD 信号失调的典型发育缺陷。此外，丝氨酸 / 苏氨酸蛋白磷酸酶 CTDNEP1 在 TGF-β 信号传导中的作用也不明确，尽管在多种生物模型中，CTDNEP1 功能缺失会导致 TGF-β/SMAD 信号增强，暗示其为该通路的负调节因子，但具体机制仍扑朔迷离。这些问题严重阻碍了对 TGF-β 信号通路精准调控机制的深入理解，也限制了相关疾病治疗策略的开发。

为了攻克这些难题，来自英国牛津大学 Sir William Dunn 病理学院以及纽卡斯尔大学等机构的研究人员，踏上了探索 TGF-β/SMAD 信号通路失活机制的征程。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为该领域带来了新的曙光。

研究人员运用了多种关键技术方法。在蛋白相互作用研究方面，采用免疫沉淀（IP）技术结合质谱分析，鉴定 CTDNEP1、MAN1 等蛋白的结合伙伴；构建 CRISPR/Cas9 介导的基因敲除细胞系，研究相关蛋白缺失对 R-SMAD 去磷酸化及信号通路的影响；利用免疫印迹（WB）和免疫荧光（IF）技术，检测蛋白表达水平、磷酸化状态及细胞定位；通过体外磷酸酶实验，验证 CTDNEP1 对 R-SMADs 的直接去磷酸化作用；运用实时定量聚合酶链反应（RT-qPCR）测定相关基因的转录水平；借助细胞增殖实验和流式细胞术评估细胞增殖状态。

研究结果

1. CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶与核内膜蛋白 MAN1 相互作用：研究人员将 CTDNEP1 融合 FLAG 标签后在 HeLa 细胞中表达，通过免疫沉淀和质谱分析发现，其调节亚基 NEP1R1 和核内膜蛋白 MAN1 是 CTDNEP1 的结合伙伴。进一步实验证实，CTDNEP1、NEP1R1 与 MAN1 的相互作用不依赖于 CTDNEP1 的磷酸酶活性，且该相互作用具有特异性，SUN1 等其他丰富的核内膜蛋白未参与其中。
2. R-SMADs 与 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶复合物相互作用：利用 V5-MAN1 共免疫沉淀结合质谱分析，发现内源性 CTDNEP1、NEP1R1 和 R-SMADs（1、2、3、5）是 MAN1 的主要相互作用蛋白，且 CTDNEP1-FLAG 和 NEP1R1-HA 能与 V5-MAN1 及 R-SMADs（SMAD1 和 2）共沉淀，而 Co-SMAD SMAD4 未被检测到。这表明 R-SMADs 与 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶复合物存在相互作用。
3. CTDNEP1、NEP1R1 和 MAN1 是 R-SMAD 去磷酸化所必需的：刺激细胞产生磷酸化的 R-SMADs 后，研究人员分析其去磷酸化动力学。结果显示，在亲本 HeLa 细胞中，磷酸化 SMAD2 的半衰期小于 60 分钟，PPM1A 基因敲除不影响 SMAD2 去磷酸化动力学；而 MAN1、CTDNEP1 或 NEP1R1 缺失则强烈抑制 SMAD2 去磷酸化，且导致 SMAD2 在细胞核内持续积累。同样，MAN1、CTDNEP1 和 NEP1R1 基因敲除细胞在 BMP 激活后，SMAD1/5/8 去磷酸化也明显减慢。此外，野生型 CTDNEP1 在 CTDNEP1 基因敲除细胞中的重新表达可恢复 SMAD2 正常去磷酸化动力学，而催化失活的 CTDNEP1^{D67E, D69T}则无法促进 SMAD2 去磷酸化，且 PPM1A 过表达也不能弥补 CTDNEP1 缺失的影响。体外实验也证实，CTDNEP1 能浓度依赖性地使 SMAD2 去磷酸化，而 CTDNEP1^{D67E, D69T}则无此功能。这些结果表明，R-SMAD 去磷酸化需要 MAN1 和 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶的参与。
4. MAN1 是 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶的 R-SMAD 适配体：在 MAN1 基因敲除细胞中，CTDNEP1-FLAG 和 NEP1R1-HA 与 SMAD1 和 SMAD2 的相互作用消失，但 MAN1 缺失不影响 CTDNEP1 的定位及其与 NEP1R1 的相互作用。结构分析和突变实验表明，MAN1 与 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶复合物的相互作用依赖于 NEP1R1 与 MAN1 跨膜区域的结合，MAN1 的 C 末端区域（包含 UHM 结构域）负责与 R-SMADs 结合。MAN1 基因敲除细胞中 SMAD2 去磷酸化缺陷可通过野生型 MAN1 的表达恢复，而与 CTDNEP1-NEP1R1 或 R-SMADs 结合受损的 MAN1 突变体则无法恢复，这表明 MAN1 作为核内膜支架，通过特定结构域分别与 R-SMADs 和 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶复合物结合，促进 R-SMAD 去磷酸化。
5. CTDNEP1、NEP1R1 和 MAN1 抑制不适当的 SMAD 信号传导：敲低 CTDNEP1、NEP1R1 或 MAN1 会导致 SMAD2 在细胞核内积累，即使在没有外源性 TGF-β 配体的情况下也是如此，且这种积累伴随着 SMAD2 磷酸化水平的增加。添加抗 TGF-β 配体的中和抗体 1D11 可部分降低 CTDNEP1 基因敲除细胞中磷酸化 SMAD2 的水平，但无法完全抑制，表明 TGF-β 受体具有一定的基础激酶活性，通常由 CTDNEP1 的磷酸酶活性来平衡。此外，CTDNEP1、NEP1R1 或 MAN1 基因敲除细胞中，SMAD 靶基因（如细胞周期抑制剂 p15、p21）的表达增加，导致细胞生长抑制。这说明 CTDNEP1-NEP1R1-MAN1 复合物不仅在 TGF-β 配体刺激后使 R-SMAD 失活，还在抑制由自分泌和 TGF-β 受体基础激活引起的异常 SMAD 信号传导中发挥关键作用。

研究结论与讨论

该研究成功确定了 R-SMAD 失活的去磷酸化机制，鉴定出 CTDNEP1-NEP1R1 为长期寻找的 R-SMAD 磷酸酶。在核内膜上，MAN1 作为支架蛋白，将 CTDNEP1-NEP1R1 磷酸酶与磷酸化的 R-SMADs 连接起来，促进其去磷酸化，从而精确调控 TGF-β 信号通路。这一发现为解释先前数学建模和时间进程实验结果提供了机制基础，即 TGF-β 信号的精确调控需要 R-SMADs 在细胞核内而非细胞质中去磷酸化。

同时，该研究为理解 CTDNEP1 和 MAN1 突变导致的多种生物表型提供了分子框架。在小鼠中，CTDNEP1 全身缺失会导致胚胎致死，条件性敲除会导致多种组织中 SMAD 信号失调；MAN1 突变则会引发多种以骨密度增加为特征的疾病。此外，在侵袭性髓母细胞瘤中，CTDNEP1 突变与 MYC 癌基因扩增及 TGF-β 信号增强相关，未来研究可进一步探索 CTDNEP1 在这些过程中的具体作用机制。

此外，研究还揭示了 NEP1R1 在 SMAD 调节中的关键作用，除了稳定 CTDNEP1 外，它还促进磷酸酶复合物与 MAN1 的相互作用。这为深入研究 NEP1R1 的功能提供了新的方向。

总的来说，这项研究在 TGF-β/SMAD 信号通路研究领域取得了重要突破，为相关疾病的发病机制理解和治疗策略开发提供了关键理论依据，有望推动生命科学和健康医学领域的进一步发展。