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为解决现有 CRISPR 基因编辑技术在构建基因工程小鼠模型（GEMMs）时存在的技术挑战和效率限制等问题，研究人员开展了 CRISPR-VLP 诱导的靶向诱变（CRISPR-VIM）策略研究。结果显示该方法能高效精准编辑基因组，且简便加速 GEMMs 生成，对生物医学研究意义重大。
在生命科学研究的广阔领域中，基因工程小鼠模型（Genetically engineered mouse models，GEMMs）就像是一把把钥匙，帮助科学家们打开探索疾病机制、研发治疗策略以及推动基础生物学研究大门。而 CRISPR 基因编辑技术的出现，更是让构建这些模型变得相对容易。然而，现有的技术并非完美无缺。传统方法在对受精卵（zygotes）进行基因编辑时，常采用直接显微注射或电穿孔的方式，将质粒、mRNA 或核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）导入细胞。但 RNP 存在蛋白纯化困难的问题，并且这些物理递送方法不仅需要专业技术和昂贵设备，还可能对胚胎造成损伤，严重限制了它们在构建 GEMMs 中的应用。
为了突破这些困境，来自韩国大学医学院生理学系、首尔国立大学等机构的研究人员展开了深入研究。他们提出了一种创新的方法 ——CRISPR-VLP 诱导的靶向诱变（CRISPR-VLP-induced targeted mutagenesis，CRISPR-VIM）策略。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为基因工程小鼠模型的构建带来了新的曙光。
研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是利用病毒样颗粒（Virus-like particles，VLPs）来递送基因编辑工具，VLPs 结构与病毒相似，但不含病毒遗传物质，能确保安全有效地输送 CRISPR 相关的 RNP。其次，通过对细胞系和小鼠受精卵进行实验，评估基因编辑效率。在实验过程中，使用了基因分型技术，如靶向深度测序、Sanger 测序和酶切等方法来鉴定编辑结果，还通过免疫印迹、免疫组化等技术对小鼠模型的表型进行分析 。
研究结果如下：
- 优化 CRISPR-RNP 的递送条件：研究人员全面评估了包装有 SpCas9/sgRNA 或 ABE8e/sgRNA 的 VLPs 在细胞系（如 HEK293T、ARPE19、小鼠胚胎干细胞（mouse embryonic stem cells，mESCs）和 Neuro-2a 细胞）和小鼠受精卵中的基因编辑效率。发现不同类型的 VLPs 在不同细胞系和靶基因中的编辑效率有所差异，但多数情况下，5 - 25 μl 的 VLPs 处理组可使基因编辑效率达到饱和，部分靶点即使在 1 μl VLPs 处理时也能有高达 97.3% 的编辑效率。在小鼠受精卵中，SpCas9/sgRNA 通过 VLPs 递送，基因编辑效率最高可达 99.9%；优化处理条件后，ABE8e/sgRNA 包装的 VLPs 处理 20 小时，Tyr 和 Plin1 的基因编辑效率分别可达 49.4% 和 76.5%，且无明显细胞毒性。
- 生成 Plin1 基因敲除小鼠：利用 CRISPR-VIM 方法，研究人员成功生成了 Plin1 基因敲除小鼠。将携带靶向 Plin1 exon 2 的 SpCas9/sgRNAs 的 VLPs 与受精卵共培养，经胚胎移植后获得了 Plin1 突变后代。对 F1 代和 F2 代小鼠的研究发现，突变可稳定遗传，且 Plin1 基因敲除小鼠的脂肪细胞变小，F4/80 巨噬细胞浸润增加。
- 体外受精（IVF）过程中的靶向诱变：研究人员将 CRISPR-VIM 方法应用于 IVF 过程，在受精后阶段使用包装有 ABE8e/sgRNA 的 VLPs 处理，Gata3 和 Plin1 的编辑效率分别高达 76.7% 和 81.9%。通过该方法还成功创建了 Tyr 突变小鼠，且突变可稳定遗传至 F2 代，表现出 Himalayan 表型。
- 基于密码子优化的 CBE 的靶向诱变：研究人员将 CRISPR-VIM 方法应用于胞嘧啶碱基编辑器（cytosine base editor，CBE）。通过对 VLP 包装进行优化，提高了 CBE 的 C - T 转换效率。在细胞系中，优化后的 CBE 对人源和小鼠靶点的 C - T 转换效率分别提高了 2.3 倍和 6.5 倍；在小鼠受精卵中，对 Dnmt1 和 Hpd 靶点的 C - T 转换效率最高分别可达 7.3% 和 13.9%。
- 通过 CRISPR-VIM 方法进行敲入：研究人员采用创新的敲入策略，将供体 DNA 包装到腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）中，与 VLP 包装的 CRISPR-RNPs 共培养。在小鼠细胞和受精卵中，通过优化 AAV 供体系统，使用 scAAV/6 血清型作为供体，在 Tyr 基因和 Kcnq4 基因中成功实现了敲入，敲入效率在细胞系和小鼠中表现良好，且可稳定遗传。
- 多靶点基因编辑：研究人员在细胞系和小鼠受精卵中使用 CRISPR-VIM 方法进行多靶点基因编辑。在细胞系中，多种编辑策略（combi、double、triple 和 quadruple）均有效，且 quadruple 方法在多个基因位点实现了较高的编辑效率。在小鼠中，combi 和 triple 方法虽能实现多靶点编辑，但效率随靶点数量增加而降低，限制靶点数量为两个时更有效，且通过 combi 方法产生的小鼠模型突变可稳定遗传至 F2 代，获得了双靶点纯合突变体。
研究结论和讨论部分表明，CRISPR-VIM 方法克服了现有胚胎编辑技术的局限性，无需依赖专业技术人员和特殊设备，不仅适用于小鼠受精卵，还可应用于 IVF。该方法成功生成了多种基因编辑小鼠模型，且无脱靶效应，同时具备多靶点编辑和复杂基因修饰模型构建的能力。然而，目前仍需进一步优化 HDR 介导的敲入和 CBE 编辑，改进 VLPs 的转导效率、减少免疫反应并实现精准靶向，以进一步提升该方法的性能。总体而言，CRISPR-VIM 方法为胚胎基因编辑和动物模型构建提供了新的有力工具，具有广阔的应用前景，有望推动生命科学和健康医学领域的研究取得更多突破。
