Small molecule BLVRB redox inhibitor：开启血小板生成调控的新征程

在血小板生成调控机制研究中，为探究非血小板生成素（TPO）/c-MPL 轴的调控路径，研究人员针对胆绿素 IXβ 还原酶（BLVRB）开展研究。结果发现选择性 BLVRB 小分子抑制剂可促进巨核细胞生成和应激血小板生成，这为血小板减少症治疗提供了新策略。

　　在人体的生理过程中，血小板就像一群勤劳的 “小卫士”，在止血、血栓形成和免疫反应等方面发挥着关键作用。正常情况下，血小板的生成受到精密调控，其中血小板生成素（TPO）/c-MPL 轴是重要的调节通路。然而，人们逐渐发现，即使在 c-MPL 缺乏的情况下，机体依然能够产生巨核细胞（MK）和血小板，这暗示着存在其他尚未被完全揭示的调控机制。此前研究表明，胆绿素 IXβ 还原酶（BLVRB）的氧化还原功能在造血谱系命运的血小板生成途径中具有重要意义，但具体作用机制尚不明确。为了深入探究这一神秘的调控机制，来自美国等地多个研究机构的研究人员开展了一系列研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。在计算建模方面，通过对 12 个 BLVRB 的蛋白质数据库（PDB）条目进行分析，运用 Glide XP 精度模拟配体结合模式，筛选出适合对接研究的结构；同时利用 PharmScreen 进行基于配体的虚拟筛选，评估分子间的疏水相似性。在化合物合成与表征上，从头合成了两类小分子化合物（Series 1 和 Series 2），并通过正交筛选、结晶研究、核磁共振（NMR）滴定等方法对其与 BLVRB 的结合模式和活性进行深入探究。此外，还进行了细胞实验，使用多种细胞系和造血干细胞（HSCs）进行研究；并构建小鼠模型，开展体内实验观察药物效果。

研究结果如下：

• 分子建模：研究人员通过对多个 BLVRB 的 PDB 结构分析，确定了 BLVRB/NADPH/ 奥沙拉嗪（Olsalazine，7ERA）和 BLVRB/NADPH/ 地拉罗司（Deferasirox，7ERC）作为最佳对接研究的 PDB 结构。在此基础上，运用虚拟筛选分析比较配体与高亲和力参考分子的相似性，并通过支架跳跃和计算机模拟分析强化结构分析，发现不同化合物与 BLVRB 的结合模式存在差异，关键氨基酸残基 Arg¹⁷⁰和 Arg¹⁷⁴在底物结合中发挥重要作用。
• 药物化学和构效关系：从头合成的小分子化合物经过筛选和活性测试，确定了两类化合物的构效关系。例如，对于 Series 1 中的二氮杂双环衍生物，左环羧酸位于对位时活性较好，右环邻位引入氯原子可增强活性；而 Series 2 中的吡唑并嘧啶酮衍生物，分子左侧引入羧酸基团可显著提高活性，且环上烷基取代基的改变也会影响活性。同时，实验证实这些抑制剂对 BLVRB 具有选择性抑制作用，对 BLVRA 无明显抑制。
• BLVRB / 小分子结晶研究：解析了 BLVRB 与 BCT1028、BCT2029 的三元晶体结构，发现两种化合物均定位于 BLVRB 活性位点，与 NADP⁺辅因子的烟酰胺部分存在环堆积作用，并与多个氨基酸残基形成疏水相互作用、氢键和盐桥。此外，通过分子动力学（MD）模拟进一步验证了结合位点的稳定性。
• 结合模式的表征：NMR 滴定实验证实了化合物在溶液中与 BLVRB 活性位点的结合，与晶体结构特征一致。通过与天然胆红素异构体的置换实验，进一步确定抑制剂靶向相同的底物结合位点，且亲和力较强。
• 原型先导 BLVRB 小分子抑制剂的代谢特征：对化合物的代谢特征研究表明，二氮杂双环类化合物（如 BCT1028）比吡唑并嘧啶酮类化合物具有更有利的药代动力学（PK）和代谢稳定性，口服生物利用度高，且脱靶效应低。
• BLVRB 抑制在 E/Meg 谱系细胞模型中的促巨核细胞生成作用：研究发现 K562 和 HEL 细胞系中 BLVRB 表达较高，且具有双谱系分化潜能。BCT1028 处理后，这些细胞呈现出典型的巨核细胞分化特征，如细胞体积增大、细胞质内容物增加，同时细胞表面巨核细胞特异性标记物 CD61 表达上调，而红细胞相关标记物表达下降，且该过程与细胞内活性氧（ROS）积累相关。
• 体外造血干细胞中的比较和血小板生成素协同作用：在 TPO 定向悬浮培养的 HSCs 中，BCT1028 能显著促进 CD41a 和 CD61⁺巨核细胞的扩增，且与 TPO 具有协同作用；但在多能祖细胞培养中，单剂量 BCT1028 不能有效促进集落扩增或谱系定向分化。
• 生物可利用的 BCT1028 增强体内应激血小板生成过程中的血小板恢复：在小鼠模型中，BCT1028 处理可显著提高 5 - 氟尿嘧啶（5FU）诱导的应激造血恢复过程中血小板的峰值恢复水平，增加网织血小板数量，提高血小板质量指数（PMI），表明止血功能得到改善。同时，对骨髓和脾脏的分析显示，BCT1028 处理后小鼠的骨髓和脾脏中巨核细胞标记物表达上调，证实其促进了巨核细胞的生成。

研究结论和讨论部分指出，该研究通过计算建模和从头化学合成，成功开发出具有药物特性的新型小分子，可选择性抑制 BLVRB 的氧化还原活性。先导化合物 BCT1028 在体外和体内均展现出促进巨核细胞生成和增强应激血小板生成的特性，且无明显不良影响。这不仅为血小板减少症的治疗提供了新的潜在策略，也为进一步研究 BLVRB 在造血过程中的作用机制奠定了基础。然而，目前仍有一些问题有待解决，例如 BCT1028 对红细胞生成的影响机制尚不明确，以及其与 TPO-RA 联合使用在免疫性血小板减少症（ITP）和化疗诱导的血小板减少症（CIT）治疗中的效果和安全性还需进一步研究。尽管如此，该研究成果为未来的研究和临床应用提供了重要的方向和理论依据，有望为相关血液疾病的治疗带来新的突破。