膀胱癌癌细胞富含蛋白质二硫键异构酶的细胞外囊泡促进膀胱肿瘤存活与恶性转化：潜在机制与临床意义

《Oncogene》：Protein disulfide isomerase-enriched extracellular vesicles from bladder cancer cells support tumor survival and malignant transformation in the bladder

为探究膀胱癌（BC）高复发率的机制，罗彻斯特大学医学中心的研究人员开展了关于蛋白质二硫键异构酶（PDIA1）在 BC 恶性发展中作用的研究。结果发现 BC 细胞通过释放富含 PDIA1 的细胞外囊泡（EVs）维持自身存活并诱导正常尿路上皮细胞恶变，这为预测 BC 复发提供了新的生物标志物 。

　　在泌尿系统癌症的领域中，膀胱癌（Bladder Cancer，BC）像一个难以攻克的 “堡垒”，给患者带来了极大的困扰。超过 70% 新诊断的膀胱癌患者属于非肌肉浸润性膀胱癌（Non-Muscle Invasive Bladder Cancer，NMIBC），这类患者面临着极高的肿瘤复发率，高达三分之二的患者会在五年内出现肿瘤复发，15 年内复发率更是高达 88%。为何膀胱癌如此 “顽固”，频繁复发？目前，对于这一现象背后的机制尚未完全明确。有一种理论认为，癌症场效应（cancer field effect）可能在其中发挥了重要作用，即癌前细胞更易发展成肿瘤，导致肿瘤呈现多中心、多阶段生长的特性，但具体的发生机制仍迷雾重重。

此外，内质网应激（Endoplasmic Reticulum Stress，ER stress）与肿瘤的发生发展关系密切。在肿瘤细胞中，内质网应激和未折叠蛋白反应（Unfolded Protein Response，UPR）常常被激活，这虽然在一定程度上有助于肿瘤细胞在应激环境中存活，但过度或持续的内质网应激也可能引发病理改变，促进肿瘤发生。蛋白质二硫键异构酶（Protein Disulfide Isomerase，PDI）家族成员，尤其是 PDIA1，在这一过程中扮演着重要角色。它不仅参与蛋白质折叠过程中催化二硫键的形成和异构化，还与肿瘤细胞的增殖、侵袭以及患者的预后相关。然而，PDIA1 的具体作用机制，以及它如何与肿瘤细胞的生存和恶性转化相互关联，仍然有待深入研究。

为了揭开这些谜题，罗彻斯特大学医学中心（University of Rochester Medical Center）的研究人员开展了一项极具意义的研究。他们致力于探究 PDIA1 在膀胱癌恶性发展中的调节作用，聚焦于 PDIA1 活性的稳态维持、细胞外囊泡（Extracellular Vesicles，EVs）在其中的作用，以及富含 PDIA1 的 EVs 诱导正常尿路上皮细胞转化的机制。同时，研究人员还通过回顾性组织芯片分析，探究 PDIA1 表达与 NMIBC 复发之间的潜在关联。该研究成果发表在《Oncogene》杂志上，为膀胱癌的研究带来了新的曙光。

研究人员在此次研究中使用了多种关键技术方法。细胞实验方面，对细胞进行培养，通过转染短发夹 RNA（shRNA）构建稳定敲低 PDIA1 的细胞系，以探究 PDIA1 对膀胱癌细胞的影响。细胞外囊泡的研究上，采用差速离心法从细胞培养上清中分离 EVs，后续对其进行相关检测和分析。为了探究细胞的恶性转化情况，开展了软琼脂集落形成实验。针对基因层面，利用全基因组测序技术分析细胞的突变情况。在临床样本研究上，构建包含 121 例 NMIBC 患者的组织芯片（Tissue Microarray，TMA），对相关蛋白的表达进行检测和分析。

研究结果主要包含以下几个方面：

• PDIA1 表达与膀胱癌细胞存活的关系：研究人员利用 shRNA 敲低 TCCSUP BC 细胞中的 PDIA1，并用衣霉素（tunicamycin，一种内质网应激诱导剂）处理细胞。结果发现，衣霉素会增加表达对照 shRNA 的 TCCSUP 细胞中碘化丙啶（PI）阳性细胞的频率，而对 PDIA1 敲低的细胞无明显影响。同时，PDIA1 敲低降低了衣霉素诱导的 caspase-3 激活程度，增强了细胞的克隆形成能力。在 J82 BC 细胞系中也观察到类似现象。这表明在 ER stress 升高的情况下，PDIA1 的沉默能恢复膀胱癌细胞对这种应激的耐受性。进一步研究发现，PDIA1 敲低可显著降低基础 H₂O₂水平，抑制衣霉素诱导的 H₂O₂产生，影响氧化应激相关基因的表达和谷胱甘肽（GSH）与氧化型谷胱甘肽（GSSG）的比例。由此推测，在 ER stress 升高时，PDIA1 介导的活性氧（ROS）生成可能破坏膀胱癌细胞内的氧化还原稳态，导致细胞凋亡死亡；而在 ER stress 降低时，PDIA1 可能发挥促生存作用。
• 膀胱癌细胞通过 EV 释放维持 PDIA1 稳态：研究发现，衣霉素处理 TCCSUP 细胞后，其释放的 EVs 中 PDIA1 水平显著增加，而在非转化的 SV-HUC 尿路上皮细胞中无此现象。免疫荧光染色显示，衣霉素处理后，PDIA1 与外泌体 / 多囊泡体标记物 TSG101 在 TCCSUP 和 J82 BC 细胞中共定位，但在 SV-HUC 细胞中不明显。对 PDIA1 的氧化还原状态分析表明，TCCSUP 细胞和 SV-HUC 细胞内大部分 PDIA1 以氧化形式存在，但衣霉素处理后，TCCSUP 细胞中还原型 PDIA1 的频率显著上升，且 TCCSUP 细胞来源的 EVs 中大部分 PDIA1 为氧化形式。此外，TCCSUP 细胞在基础状态下释放的 EVs 比 SV-HUC 细胞多，衣霉素处理进一步增加了 EVs 的释放。这表明肿瘤细胞可能在 ER stress 过高时，将氧化型 PDIA1 包装进 EVs 排出细胞，以维持细胞存活和减轻氧化应激。
• 富含 PDIA1 的 BC 来源 EVs 对受体尿路上皮细胞的影响：从转染 shPDIA1 或对照 shRNA 的 TCCSUP 细胞中分离 EVs，处理非转化的 SV-HUC 细胞。结果显示，与对照 EVs 相比，shPDIA1 EVs 处理的细胞中 ROS 水平、DNA 损伤水平显著降低，集落形成率也明显下降。将重组 PDIA1（rPDIA1）恢复到 shPDIA1 EVs 中后，其诱导 ROS 产生、促进 NFE2L2 表达、增加 DNA 损伤和促进细胞恶性转化的能力得以恢复。在转化后的 SV-HUC 细胞中敲低 PDIA1，对其锚定非依赖生长无影响。这表明 PDIA1 是 EV 诱导受体尿路上皮细胞恶性转化的关键驱动因素，但在细胞恶性转化后，维持恶性状态并不依赖 PDIA1。
• 富含 PDIA1 的 EV 转化细胞的突变特征：对转化后的 SV-HUC 细胞进行全基因组测序，发现其体细胞突变负担增加，非沉默突变和受影响基因数量增多。单碱基替换（Single Base Substitutions，SBS）分析显示，转化细胞中所有六类 SBS 均增加，其中 C 到 A 的颠换增加最为显著，这是 ROS 诱导 DNA 改变的典型特征。此外，还鉴定出一些在转化细胞中显著增强的突变特征，如 COSMIC 签名 SBS18，这也与 ROS 诱导的 DNA 损伤相关。这表明肿瘤来源的 PDIA1 在诱导尿路上皮细胞的氧化 DNA 损伤过程中起核心作用。
• PDIA1 表达与 NMIBC 患者肿瘤复发的关系：构建包含 121 例 NMIBC 患者的组织芯片，分析 PDIA1 和 BiP（一种内质网应激标记蛋白）的表达。结果发现，肿瘤复发患者的肿瘤组织中 BiP 和 PDIA1 水平显著更高，且非内质网定位的 PDIA1 水平也更高。生存分析显示，较高的 BiP 和 PDIA1 表达与患者无复发生存期显著缩短相关。这表明肿瘤组织中较高的 ER stress 水平和 PDIA1 表达与 NMIBC 复发风险增加相关，PDIA1 可作为预测 NMIBC 复发风险的有价值的生物标志物。

综合上述研究结果，该研究揭示了膀胱癌复发的新机制。膀胱癌细胞在 ER stress 条件下，通过释放富含氧化型 PDIA1 的 EVs 来维持自身存活，这些 EVs 被正常尿路上皮细胞摄取后，可诱导细胞发生恶性转化，增加肿瘤复发风险。PDIA1 和 ER stress 水平有望成为预测 NMIBC 复发的生物标志物，为膀胱癌的诊断和治疗提供了新的潜在靶点和思路。然而，研究也存在一些局限性，如使用衣霉素作为 ER stress 诱导剂无法完全区分其与 PDIA1 的 ER 相关功能；BC 细胞将氧化型 PDIA1 包装进 EVs 的具体机制尚不清楚；PDIA1 富集的 EVs 的作用是否完全由 PDIA1 介导也有待进一步研究。未来，还需要更多的研究来深入探讨这些问题，以推动膀胱癌防治领域的发展。