单细胞转录组与 RNA 测序揭示子痫前期免疫相关标志物：探索发病机制与潜在治疗靶点

《Reproductive Sciences》：Single-Cell Transcriptome and RNA Sequencing Reveal Immune-Related Markers of Preeclampsia

子痫前期（preeclampsia）严重威胁母婴生命，但发病机制不明。本文通过单细胞和 RNA 测序，对比子痫前期与正常胎盘免疫微环境，发现巨噬细胞在其中的关键作用及相关靶点基因，为解释发病机制和临床治疗提供新思路。

　　

子痫前期研究背景

子痫前期是孕期特有的并发症，全球 4 - 5% 的孕妇会受影响，每年导致大量母婴死亡。其主要症状有高血压、蛋白尿，严重时会损害肝肾功能，引发头晕、恶心等神经症状，若不治疗，还会导致母婴多种不良结局。正常妊娠是 “免疫耐受” 状态，胎盘血管正常发育为胎儿提供养分。而子痫前期患者胎盘血管发育和功能异常，引发血压调节异常和血流受限。目前认为其发病机制主要涉及螺旋动脉重塑失败和胎盘血管内皮功能障碍，同时伴有母体炎症免疫反应过度激活。现有治疗手段只能缓解病情，深入研究子痫前期与免疫反应的关系，有助于开发新的治疗策略。

研究方法

1. 数据收集与质量控制：从 GEO 数据库获取 4 个样本的单细胞 RNA 测序数据（2 个子痫前期胎盘样本、2 个正常样本，来自 GSE173193 数据集）和 171 个样本的 RNA 测序数据（66 个子痫前期胎盘样本、105 个正常样本，来自 GSE234729 和 GSE25906 数据集）。对单细胞数据进行质量控制，去除低质量细胞。利用主成分分析评估细胞周期相关基因对细胞聚类的影响。
2. 单细胞 RNA 测序数据分析：使用 Seurat 包对 GSE173193 数据集原始数据进行归一化降维、聚类，参考相关文献鉴定各簇标记基因，结合 SingleR 软件注释细胞类型，筛选差异基因确定细胞亚型。
3. 差异表达免疫相关基因的鉴定与评分：从 Immport 数据库下载免疫相关基因，与单细胞差异基因取交集得到免疫相关差异基因，用 AUCellR 软件包对单细胞进行评分，筛选免疫相关细胞亚群。
4. 细胞亚型差异基因及功能富集分析：根据参数筛选细胞差异基因，基于 ClusterProfiler 包进行基因本体富集（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）功能富集分析。
5. 拟时分析：运用 Monocle2 包和 DDRTree 算法探索巨噬细胞发育分化轨迹，展示巨噬细胞亚型标记基因沿发育轨迹的变化。
6. CellChat 细胞通讯分析：利用 CellChat 包推断细胞间通讯网络和内部调节信号，通过细胞通讯评分反映细胞间相互作用。
7. Scenic 转录因子调控网络分析：借助 Scenic 包基于共表达和 DNA 基序分析推断基因调控网络，分析各细胞网络活性，识别转录因子及其靶基因。
8. 转录组学验证差异基因表达：使用 TinyArray 软件对 GSE234729 和 GSE25906 数据集关键靶基因数据进行差异分析，筛选与子痫前期相关的关键基因。

研究结果

1. 子痫前期与对照胎盘的单细胞转录组：对 GSE173193 数据库单细胞 RNA 测序数据进行分析，去除低质量细胞后，发现细胞周期对聚类无影响，不同组间基因表达水平和基因数量相关性高。通过 UMAP 可视化聚类得到 35 个细胞簇，注释为 10 种主要细胞类型。子痫前期组上皮细胞和中性粒细胞比例较高，对照组单核细胞数量更多。
2. 单细胞免疫评分结果：对所有细胞类型的免疫相关基因表达进行评分，发现巨噬细胞免疫评分最高，其次是单核细胞，上皮细胞最低，后续重点分析巨噬细胞和单核细胞在子痫前期中的作用。
3. 子痫前期与胎盘免疫炎症反应的关联：对巨噬细胞和单核细胞进行差异表达基因（DEGs）及功能富集分析，GO 富集结果显示，子痫前期组巨噬细胞 DEGs 富集于细胞因子产生的正调控、免疫效应过程的调节等；单核细胞 DEGs 富集于免疫反应调节的细胞表面受体信号通路等。KEGG 富集结果表明，巨噬细胞和单核细胞均富集于趋化因子信号通路。重新定义胎盘巨噬细胞后得到 16 个亚簇，可细分为巨噬细胞、单核细胞和霍夫鲍尔细胞（Hofbauer cells），子痫前期组巨噬细胞更普遍。
4. 子痫前期胎盘巨噬细胞的分化：拟时分析发现单核细胞可分化为巨噬细胞和 Hofbauer cells。随着细胞分化，部分免疫相关基因和血管内皮生长因子调节相关基因表达发生变化，表明巨噬细胞亚型与子痫前期异常免疫调节有关。
5. 子痫前期胎盘巨噬细胞与其他细胞类型的相互作用：细胞通讯分析显示，对照组细胞间通讯数量更多、强度更强，子痫前期组不同信号通路通讯减少，CCL 和 Visfatin 信号通路下降更明显。巨噬细胞三种亚型间通讯频繁，SPP1 - CD44 受体 - 配体对在通讯中作用最强。
6. 巨噬细胞作为调节子痫前期的主要细胞类型：分析子痫前期组巨噬细胞三种亚型的转录因子靶基因，与 DEGs 取交集，筛选出单核细胞和巨噬细胞中与子痫前期相关的差异靶基因。基于 GSE234729 和 GSE25906 数据集进一步评估，确定 7 个基因（SLC9A9、SH2B3、SDC3、RCC2、F13A1、CCL2、CBLB）在转录组中差异表达趋势一致且在巨噬细胞中高表达，表明巨噬细胞在调节子痫前期中起重要作用。

研究讨论

胎盘发育复杂且高度有序，免疫细胞参与调节血管重塑和血管生成。子痫前期胎盘免疫功能改变，GO 和 KEGG 富集结果显示其细胞功能集中在炎症和免疫反应，合理免疫调节对胎盘正常发育至关重要。Hofbauer cells 是胎盘特有的巨噬细胞，正常妊娠时发挥免疫抑制作用，参与血管生成和组织重塑。在子痫前期中，其通过 leptin - LEPR 信号通路发挥促炎作用，影响疾病进展。子痫前期会破坏胎盘稳态，导致血管缺陷，甚至胎儿死亡。研究发现子痫前期组巨噬细胞三种亚型中 SPP1、Annexin、MIF 等信号通路受抑制，这些信号通路与胎盘发育和疾病发生相关，可能是子痫前期潜在的信号通路。研究还发现巨噬细胞中的 SLC9A9、SH2B3 等 7 个基因可能与子痫前期相关，部分基因已有研究证实，其他基因作用有待进一步探索。本研究存在局限性，样本量较小，且相关基因和信号通路需结合临床样本深入分析，胎盘与母体间复杂调节机制也需更多研究。

研究结论

本研究通过单细胞转录组结合 RNA 测序分析子痫前期胎盘免疫微环境，揭示了巨噬细胞在调节子痫前期中的重要作用，获得潜在疾病标志物，为解释子痫前期发病机制和临床治疗提供了新视角和策略。