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在神经疾病研究中，细胞外囊泡（EVs）作为生物标志物潜力巨大，而 L1 细胞粘附分子（L1CAM）常被用于富集神经元来源的 EVs，但缺乏充分验证。研究人员利用多种来源和方法评估 L1CAM 免疫亲和法对 EVs 的富集效果，结果表明 L1CAM 并非可靠标记物，这为神经疾病生物标志物研究提供新方向。
在神经系统疾病研究领域，细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）逐渐成为研究热点。EVs 是细胞分泌的膜结合纳米颗粒，携带蛋白质、核酸和脂质等生物分子，在细胞间通讯和信号传导中发挥关键作用，尤其在大脑健康和疾病方面。因其能反映中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）等难以获取组织的生理和病理状态，在神经系统疾病生物标志物研究中极具潜力。
然而，目前在 EVs 研究中存在一些问题。可靠地分离和表征 EVs，特别是神经元来源的 EVs，是有效利用其生物标志物潜力的关键。跨膜蛋白 L1 细胞粘附分子（L1CAM，也称为 NCAM-L1 或 CD171）常被用作神经元 EVs 的标记物，用于从人类生物流体（如血液）中分离和表征神经元来源的 EVs。但这一方法的有效性和特异性尚未得到充分验证。有研究表明，L1CAM 在脑脊液和血液中可能主要以裂解形式存在，而非与 EVs 膜结合，且它在其他细胞类型中也有表达，质疑了其作为神经元特异性 EVs 标记物的可靠性。尽管如此，L1CAM 仍被广泛应用，因此迫切需要对其作为 EVs 标记物的效用进行全面评估。
为了解决这些问题，来自德国图宾根大学赫蒂临床脑研究所、德国神经退行性疾病研究中心（DZNE）等机构的研究人员开展了一项研究。研究旨在深入评估 L1CAM 免疫亲和法是否真的能富集人类生物流体中的 EVs，尤其是神经元来源的 EVs。研究人员采用多步骤验证方法，利用多种生物流体来源（血浆、脑脊液、诱导多能干细胞衍生神经元的条件培养基 [iNCM]）和不同的正交方法（质谱 [MS]、纳米颗粒跟踪分析 [NTA]）进行研究。最终研究表明，通过多种分离方法可从不同生物流体来源有效分离出 EVs，且部分 EVs 亚群源自神经元，但 L1CAM 并非可靠的 EVs 标记物，尤其是在富集神经元来源的 EVs 方面。该研究成果发表在《Molecular Neurobiology》上。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先，通过多种来源样本采集，包括人类血浆、脑脊液以及诱导多能干细胞（iPSCs）分化的神经元和造血干细胞的条件培养基。其次，采用两种常用的 EVs 分离方法，即尺寸排阻色谱法（SEC）和聚合物辅助沉淀法（PPT）。最后，运用质谱（MS）、纳米颗粒跟踪分析（NTA）、单分子阵列（SIMOA）检测神经丝轻链（NfL）、免疫沉淀（IP）和免疫印迹等技术对样本进行分析。
研究结果主要包括以下几个方面：
- SEC 可可靠分离 EVs：研究人员利用 SEC 从 iPSC 衍生神经元的条件培养基（iNCM）中分离出的 EVs，粒径在 40 - 200nm 之间，符合外泌体和微囊泡的典型大小范围，且含有 EVs 标记物 CD81 和 Flotillin-1，不含有 EVs 排除标记物 Calnexin 和 GM130，证明了 SEC 分离的 EVs 的纯度。同样的方法应用于人类脑脊液和血液，也成功分离出具有相似特征和标记物的 EVs，证实了 SEC 可从人类生物流体中可靠分离 EVs。
- NfL 表明生物流体中存在神经元来源的 EVs：研究人员在 iNCM 来源的 EVs 中检测到 NfL，而在 iPSC 衍生的造血干细胞条件培养基（iHCM）来源的 EVs 中仅检测到少量 NfL，这证实了 NfL 可作为神经元来源 EVs 的标记物。在人类脑脊液和血液来源的 EVs 中，也检测到了 NfL，尽管浓度较低，但表明这些生物流体中存在神经元来源的 EVs，且 NfL 水平与生物流体的输入体积呈正相关。
- L1CAM 免疫捕获显示其主要以游离形式存在：通过对 SEC 分离的血浆 EVs 进行 L1CAM 免疫捕获，NTA 分析显示，使用抗 L1CAM 抗体和抗 Calnexin 抗体（阴性对照）分离的颗粒大小分布相似，未观察到抗 L1CAM 抗体对 EVs 的特异性富集。免疫印迹分析表明，L1CAM 在血浆中主要以游离形式存在于非 EV 蛋白组分中，而非与 EVs 结合。同样的结果也在 PPT 分离的 EVs 中得到验证，且在 iNCM 来源的 EVs 中，L1CAM 免疫沉淀后也主要存在于非 EV 蛋白组分中。
- L1CAM 在脑脊液来源的 EVs 蛋白质组中未富集：对脑脊液来源的 EVs 进行蛋白质组学分析，发现经典的 EVs 标记物如 CD9、CD81、Flotillin-1、TSG101 等在 EVs 中高度富集，但 L1CAM 未显示出特异性富集，这进一步证明 L1CAM 并非与 EVs 特异性相关。
研究结论和讨论部分指出，该研究系统验证了使用 SEC 和 PPT 两种方法从多种人类生物流体和神经元条件培养基中分离通用 EVs 的有效性。确认了 NfL 可作为脑脊液和血液中神经元来源 EVs 的指标。然而，研究结果挑战了 L1CAM 作为 EVs，尤其是神经元来源 EVs 标记物的实用性，因为 L1CAM 在这些生物流体的 EVs 组分中并未富集，而是主要存在于非 EV 蛋白组分中。这表明 L1CAM 在神经元 EVs 上的存在可能不像之前认为的那样普遍，提示需要进一步研究替代的 EVs 标记物，尤其是神经元来源的标记物，以及更精细的分离技术。该研究为神经疾病生物标志物的研究提供了重要参考，有助于推动相关领域的发展。
