优化 3D 球体培养的酶谱分析方案：探究肿瘤细胞中 MMP-2 和 MMP-9 活性的新途径

在肿瘤研究中，传统 2D 细胞培养与体内肿瘤环境差异大，影响实验准确性。研究人员以肾癌细胞系为模型，优化酶谱分析方案研究 MMP-2 和 MMP-9 活性。结果发现 3D 培养下两种酶活性变化与 2D 不同，还分析了相关信号通路。该研究为肿瘤生物学研究提供新方法。

　　在肿瘤研究的舞台上，传统的细胞培养方式就像在 “理想温室” 里培育花朵。以往大多数肿瘤细胞系研究使用的 2D 细胞培养单层，细胞们生长在氧气、营养物质充足且分布均匀的环境中，还受塑料培养皿的影响 ，这与真实肿瘤环境相差甚远。在真实肿瘤里，细胞生活在 3D 环境，氧气、代谢物和废物浓度呈梯度分布，并且与周围微环境密切互动。而基质金属蛋白酶（MMPs）中的 MMP-2 和 MMP-9 在肿瘤细胞转移过程中，对细胞外基质（ECM）的降解起着关键作用，传统的酶谱分析多在 2D 细胞培养上进行，难以准确反映肿瘤细胞的真实情况。因此，为了更深入、准确地探究肿瘤细胞的奥秘，来自法国波尔多大学（Univ. Bordeaux）等机构的研究人员开启了一项意义非凡的研究。

研究人员以两种肾癌细胞系（WT-CLS1 和 786-O）为模型，前者来源于儿童肾横纹肌样瘤（RTK），后者来自成人透明细胞肾细胞癌（ccRCC）。他们优化了酶谱分析方案，成功开发出一种简单且低成本的检测方法，用于测量在甲基纤维素存在下建立的球体培养中 MMP-2 和 MMP-9 的活性。同时，研究人员还对 AKT 和 MAPK/ERK 信号通路进行了分析。

该研究成果发表在《BMC Biotechnology》上，为肿瘤生物学研究开辟了新道路，有助于更深入理解肿瘤细胞的行为，为未来肿瘤治疗策略的开发提供了重要依据。

研究人员在实验过程中运用了多种技术方法。在细胞培养方面，培养了 WT-CLS1 和 786-O 两种肾癌细胞系。球体形成时，使用 1% 甲基纤维素在 U 型底 96 孔板中培养细胞形成球体 。通过酶谱分析检测 MMP-2 和 MMP-9 活性；利用蛋白质免疫印迹（Western blotting）分析细胞内信号通路；采用实时定量聚合酶链式反应（RT-qPCR）检测相关基因的 mRNA 水平；借助细胞活力检测（CellTiter-Glo? 3D Cell Viability Assay）评估细胞活力。

研究结果主要分为以下几部分：

• MMP-2 和 MMP-9 活性分析：786-O 球体表达前体 MMP-9（92kDa）和活性 MMP-2（62kDa），MMP 活性随球体数量增加而增加，在胶原蛋白 I 刺激下，MMP-2 活性持续上升，前体 MMP-9 活性在 3 个及以上球体时达到平台期 。WT-CLS1 球体表达的活性 MMP-2 少于 786-O 球体，前体 MMP-9 活性高于 MMP-2 活性，且前体 MMP-9 活性随球体数量增加而稳定上升。与 2D 培养不同，3D 培养中未检测到活性 MMP-9（82kDa）和前体 MMP-2（72kDa）。胶原蛋白 I 刺激使 786-O 和 WT-CLS1 球体的前体 MMP-9 活性降低，对 786-O 球体 MMP-2 活性影响较小，在 WT-CLS1 球体中未观察到 MMP-2 活性的明显变化。通过细胞活力检测和 RT-qPCR 分析，排除了细胞活力变化和 mRNA 转录水平变化对 MMP-2 和 MMP-9 活性的影响，推测胶原蛋白 I 可能抑制 MMP9 mRNA 翻译和（或）前体 MMP-9 的分泌。
• AKT 信号通路分析：在 786-O 和 WT-CLS1 球体中，p-AKT（磷酸化的 AKT，在 Ser⁴⁷³位点磷酸化）随球体数量增加而迅速增加，2 - 3 个球体即可达到最大效应 。胶原蛋白 I 对 786-O 和 WT-CLS1 球体中 AKT 磷酸化的影响因球体数量而异，可能是由于球体融合过程干扰了缺氧 / 坏死核心的形成，影响了 AKT 的激活。
• ERK 信号通路分析：与 2D 培养相比，EGF 刺激 3D 培养的 786-O 和 WT-CLS1 球体时，ERK 激活的动力学不同。在 786-O 细胞中，2D 培养时 EGF 刺激 45min ERK 磷酸化达到最大值，3D 培养时 15min 达到最大值，45min 后恢复到基础水平；在 WT-CLS1 细胞中，2D 培养时 15min 达到最大值，3D 培养时在 45min 和 90min 才出现 ERK 磷酸化增加。

研究结论和讨论部分指出，该研究优化的酶谱分析方案可用于分析肾癌细胞球体培养中 MMP-2 和 MMP-9 的活性，且该方案简单、快速、成本效益高，可应用于任何肿瘤细胞系球体培养。研究还发现 3D 培养下 MMP-2 和 MMP-9 活性、AKT 和 ERK 信号通路的激活情况与 2D 培养存在差异。这些差异表明细胞培养方式会影响实验结果，为深入研究肿瘤细胞行为提供了新的视角。未来还需进一步研究胶原蛋白 I 和其他可溶性生长因子在球体中的穿透能力，以及它们与球体大小和细胞数量的关系。这项研究为肿瘤生物学研究提供了重要的实验依据和研究思路，有助于推动肿瘤治疗领域的发展。